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Tilman Oest

• Mycophenolat-Mofetil (MMF) hemmt die Aktivität von Mikrogliazellen und verringert den exzitotoxischen neuronalen Schaden in organotypischen hippocampalen Schnittkulturen (OHSC). Der Tractus perforans ist die wichtigste neuronale afferente Verbindung zwischen entorhinalem Kortex (EC) und Gyrus dentatus (GD) im Hippocampus. Er besteht aus Axonen, deren Ursprungsneurone im EC liegen und die im GD terminieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von MMF auf den Erhalt dieser Projektion zu untersuchen. Methodisch wurde zu diesem Zweck die Fluoreszenzmarkierung des Tractus perforans in der organotypischen hippokampalen Schnittkultur (OHSC) etabliert. Die von uns angestrebte retrograde Färbemethode sollte entorhinale Neurone unter der Voraussetzung markieren, dass deren Axone (Tractus perforans) intakt waren. Ein guter neuronaler Erhalt sollte sich in einem entsprechend erhaltenen Tractus perforans und retrograd markierten entorhinalen Neuronen wiederspiegeln. OHSC aus 8 Tage alten Wistar Ratten wurden für 9 div (days in vitro) mit oder ohne MMF (100 mikro g/ml) kultiviert. Zunächst wurde methodisch die retrograde Markierung des Tractus perforans mit dem lipophilen Farbstoff DiI (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindo-carbocyaninperchlorat) in der OHSC etabliert und mit dem hydrophilen Dextranamin Mini Ruby versucht. Die retrograde Markierung entorhinaler Neurone und die durchgängige Darstellung des Tractus perforans in der OHSC mit Mini Ruby gelang in unseren Versuchen nicht, während die Markierung mit DiI erfolgreich war. Nach der Fixierung wurde die retrograde Markierung des Tractus perforans durch das Platzieren eines DiI-Kristalles im GD eingeleitet. Die auf diese Weise mit DiI markierten entorhinalen Neurone wurden mit neuronenspezifischen Antikörpern gegen NeuN gegengefärbt und somit zweifelsfrei als Neurone identifiziert. An diesem Modell wurde der Einfluß von MMF auf die Zahl DiI/NeuN doppelmarkierter entorhinaler Neurone quantitativ ausgewertet. Die quantitative Analyse erfolgte an Bildern, die mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop gewonnen wurden. Die quantitative Auswertung retrograd mit DiI markierter OHSC zeigte, dass die Anzahl der DiI-NeuN doppelmarkierten entorhinalen Neurone in den MMF behandelten OHSC 19fach höher war als in den unbehandelten OHSC (p<0,05). Unsere Ergebnisse zeigen, dass MMF den Erhalt ganzer neuronaler Fasertrakte und Projektionen in der OHSC verbessert. Vor dem Hintergrund vorhandener Arbeiten, die auf neuroprotektive Effekte der MMF deuten, scheint MMF ein aussichtsreicher Kandidat für die Reduzierung des Sekundärschadens im Rahmen von Verletzungen des zentralen Nervensystems zu sein.
• Previous studies with excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) have revealed that the immuosuppressant mycophenolatemofetil (MMF) inhibits microglial activation and suppresses neuronal damage. The perforant path provides the connection between the entorhinal cortex (EC) and the dentate gyrus (DG) in the hippocampus. It is an afferent projection originating in the entorhinal cortex and terminating in the molecular layer of the dentate gyrus. We here investigated whether MMF exerts beneficial effects on axon survival in a long-range projection, the perforant path. We first established retrograde fluorescent labeling of the perforant path inside the OHSC. This method labels entorhinal neurons if their axons are intact. Consequently neuronal and perforant path preservation should result in retrograde labeling of entorhinal neurons. OHSC were obtained from 8-day-old Wistar rats and cultured for 9 days in vitro with or without MMF (100 micro g/ml). We first established retrograde labeling of the perforant path with the lipophilic dye DiI (1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindo-carbocyanine perchlorate) inside OHSC and also attempted a retrograde labeling with the hydrophilic dye Mini Ruby. The retrograde labeling of entrohinal neurons and the perforant path with DiI was successful whereas retrograde labeling with Mini Ruby failed. We then analysed the effects of MMF on the number of DiI/NeuN double-labeled entorhinal neurons. After fixation, the perforant path was retrogradely labeled by application of the fluorescent dye DiI in the hilus of the DG, and neuronal perikarya were immunohistochemically stained with the neuron-specific antibody anti-NeuN to identify entorhinal neurons. Analysis of DiI-labeled and NeuN-stained OHSC by confocal laser scanning microscopy revealed double-labeled neurons in the entorhinal cortex which projected to the dentate gyrus via the perforant path. Quantitative analysis showed that the number of double-labeled neurons was 19-fold higher in OHSC treated with MMF than in control cultures (p<0,05). Our findings indicate that MMF treatment improves preservation of long-range projections in the OHSC such as the perforant path. In accordance with recent studies that showed neuroprotective effects of MMF, this agent could prove to be an interesting candidate for treatment of secondary damage after lesions of the central nervous system.