Open Access

Ali Tinazli

• First milestone of this Ph.D. thesis was the successful extension of conventional NTA/His-tag technique to self-assembling, multivalent chelator thiols for high-affinity recognition as well as stable and uniform immobilization of His-tagged proteins on chip surfaces. Bis-NTA was linked via an oligoethylene glycol to alkyl thiols by an efficient modular synthesis strategy yielding a novel, multivalent compound for formation of mixed SAMs with anti-adsorptive matrix thiols on gold. Multivalent chelator chips allow a specific, high-affinity, reversible, long-term immobilization of His-tagged proteins. In AFM studies reversibility of the specific protein immobilization process was visualized at single molecule level. The entire control over the orientation of the immobilized protein promotes this chip surface to an optimal platform for studies focusing on research targets at single molecule level and nanobiotechnology. Based on the constructed protein chip platform above and a novel AFM mode (contact oscillation mode, COM) – developed during the current Ph.D. work – protein nanolithography under physiological conditions enabling fabrication of active biomolecular patterns in countless variety has been established. Reversible COM-mediated nanostructuring is exceptionally suitable for multiplexed patterning of protein assemblies in situ. The first selfassembled protein layer acts as a biocompatible and ductile patterning material. Immobilized proteins can be replaced by the AFM tip applying COM, and the generated structures can be erased and refilled with different proteins, which are immobilized in a uniform and functional manner. Multi-protein arrays can be systematically fabricated by iterative erase-and-write processes, and employed for protein-protein interaction analysis. Fabrication of two-dimensionally arranged nanocatalytic centres with biological activity will establish a versatile tool for nanobiotechnology. As an alternative chip fabrication approach, the combined application of methodologies from surface chemistry, semiconductor technology, and chemical biology demonstrated successfully how pre-patterned templates for micro- and nanoarrays for protein chips are fabricated. The surface physical, as well the biophysical experiments, proved the functionality of this technology. The promises of such process technology are fast and economic fabrication of ready-to-use nanostructured biochips at industrial scale. Membrane proteins are complicated in handling and hence require sophisticated solutions for chip technological application. A silicon-on-insulator (SOI) chip substrate with microcavities and nanopores was employed for first technological investigation to construct a protein chip suitable for membrane proteins. The formation of an artificial lipid bilayer using vesicle fusion on oxidized SOI cavity substrates was verified by CLSM. Future AFM experiments will give further insights into the chip architecture and topography. This will provide last evidence of the sealing of the cavity by the lipid bilayer. Transmembrane proteins will be employed for reconstitution experiments on this membrane protein chip platform. Highly integrated microdevices will find application in basic biomedical and pharmaceutical research, whereas robust and portable point-of-care devices will be used in clinical settings.
• Erster Meilenstein der vorliegenden Arbeit war die erfolgreiche Erweiterung des konventionellen NTA/His-tag-Konzepts auf selbst-assemblierende, multivalente Chelatorthiole für die hochaffine Erkennung und stabile, einheitliche Immobilisierung His-getaggter Proteine auf Chipoberflächen. Mittels einer effizienten, modularen Synthesestrategie wurden Bis-NTA-Module über Oligoethylenglykoleinheiten an Alkylthiole angebunden. Diese Chelatorthiole wurden zusammen mit antiadsorptiven Matrixthiolen zur Ausbildung gemischter selbst-assemblierender Monolagen (SAMs) auf Goldoberflächen eingesetzt. Die multivalenten Chelatorchips erlauben eine spezifische, hochaffine, umkehrbare und langfristige Immobilisierung His-getaggter Proteine. Die Umkehrbarkeit der spezifischen Proteinimmobilisierung wurde in rasterkraftmikroskopischen (AFM) Studien bis zur Einzel-Molekül-Ebene visualisiert. Die vollständige Kontrolle über die Orientierung immobilisierter Proteine qualifiziert diese entwickelte Chipoberfläche zu einer optimalen Plattform für Anwendungsbereiche der Einzelmolekülbiochemie und Nanobiotechnologie. Basierend auf dieser Plattform für Proteinchips und einem – im Rahmen dieser Arbeit – neuentwickelten AFM-Modus (Kontaktoszillationsmodus, COM) wurde die „Protein-Nanolithographie“ etabliert, welche die Fabrikation von aktiven, biomolekularen Strukturen in unzähliger Vielfalt ermöglicht. Die umkehrbare COM-vermittelte Nanolithographie ist insbesondere für die multiplexe Anordnung von Proteinverbänden in situ geeignet. Die erste Schicht immobilisierter Proteine fungiert als ein biokompatibles und verformbares Strukturierungsmaterial. Diese immobilisierten Proteine können nun im Kontaktoszillationsmodus mit der AFM-Spitze lokal entfernt („Löschen“) und gegen andere Proteine – die an die freigelegte Chipoberfläche ebenfalls spezifisch und funktional immobilisieren – ausgetauscht werden („Schreiben“). Arrays, bestehend aus mehreren unterschiedlichen Proteinen können nun systematisch in iterativen Lösch-und-Schreib-Vorgängen fabriziert und für Proteininteraktionsanalysen eingesetzt werden. Die Fabrikation von zwei-dimensional arrangierten nanokatalytischen Zentren mit biologischer Aktivität wird von großem Nutzen für die Nanobiotechnologie sein. Eine alternative Herstellungsmethode aus einer Kombination von Oberflächenchemie, Halbleitertechnologie und chemischer Biologie wurde für die Fabrikation von vorstrukturierten Templaten für Mikro- und Nanoarrays entwickelt. Die Funktionalität dieser Chipplattform wurde anhand oberflächen- und biophysikalischer Experimente erfolgreich gezeigt. Zukünftiges Ziel ist die Anfertigung vorstrukturierter Template in der Dimension weniger Nanometer zur Ausbildung von Bio-Arrays mit einzelnen Molekülen. Ein weiteres Ziel besteht in der kompletten Verlagerung des Herstellungsprozesses in die Gasphase. Eine Produktion in der Gasphase verspricht eine schnelle und wirtschaftliche Erzeugung sofort einsatzbereiter nanostrukturierter Biochips im industriellen Maßstab. Der Umgang mit Membranproteinen verlangt besondere Vorkehrungen im experimentellen Milieu, ebenso speziell sind die Bedürfnisse in den entsprechenden Chip-Anwendungen. Ein Chip mit Mikrokavitäten und Nanoporen, basierend auf der „Silicon-on-Insulator“ (SOI)-Technologie, wurde für erste technologische Studien zum Entwurf eines Proteinchips für Membranproteine eingesetzt. Künstliche Lipidmembranen wurden auf der SOI-Oberfläche mittels Vesikelfusion ausgebildet und mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gezeigt. Zukünftige AFM-Experimente werden weitere Einsichten in die Chiparchitektur und Topographie ermöglichen. Transmembranproteine werden in Rekonstitutionsexperimenten für funktionale Studien der Membranproteinchips eingesetzt. Anwendungsbereiche solcher hochintegrierten Mikrosysteme sind sowohl in der biologischen Grundlagenforschung als auch in mobilen Diagnostikgeräten im klinischen Einsatz zu finden.