Open Access

Mona Abdel Tawab

• Heute gewinnen pflanzliche Arzneimittel im Zeichen einer verstärkten Hinwendung zu natürlichen, relativ nebenwirkungsarmen Medikamenten zunehmend an Bedeutung, so auch die über Jahrtausende hinweg traditionell angewandte Ginsengwurzel (Panax ginseng) und der Indische Weihrauch (Boswellia serrata). Neben der Struktur- und Extraktanalytik konzentriert sich die Forschung in zunehmenden Maße darauf, die zahlreichen pharmakologisch untersuchten und klinisch beobachteten Wirkungen dieser beiden Arzneipflanzen einzelnen Inhaltsstoffen zuzuordnen. Bei der Ginsengwurzel gestaltet sich dies jedoch besonders schwierig. Dies ist begründet durch die große Anzahl strukturell ähnlicher Ginsenoside sowie durch deren unterschiedlicher Metabolismus. Zwar ist aus In-vitro-Experimenten bekannt, daß die Degradation über die stufenweise Deglukosylierung stattfindet, allerdings ist bislang nicht geklärt, ob intakte Ginsenoside überhaupt resorbiert werden und welche der vielen in vitro ermittelten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Anders als bei Ginseng, kann die therapeutische Wirkung des Indischen Weihrauches wohl definierten Inhaltsstoffen, AKBA und KBA, zugeschrieben werden. Dennoch mangelt es hier an verlässlichen pharmakokinetischen Daten, da bislang keine validierte bioanalytische Methode zur Verfügung stand. Im Rahmen der Bioanalytik von Ginsenosiden und Boswellliasäuren kamen in der vorliegenden Arbeit die Nano-ESI-MS(n)-Technik sowie die HPLC-Analytik zur Anwendung. Bereits bei der Strukturanalyse von Ginsenosiden erwies sich die Kombination der Nano-ESI-Technik mit MS(n)-Experimenten in einer Quadrupol-Ionenfalle als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu konventionellem ESI bietet Nano-ESI nicht nur den Vorzug, mit kleinsten Substanzmengen lange Messungen durchführen zu können, sondern auch den Vorteil einer effektiveren, weniger diskreminierenden Ionisation. Sowohl die hohe Sensitivität der Nano-Elektrosprayionisierung bei der Analyse von glykosidischen Verbindungen als auch die umfangreichen Strukturinformationen infolge mehrerer aufeinanderfolgender stoßinduzierter Fragmentierungen machen diese Technik zu einer attraktiven und effizienten Methode zur Analyse von Ginsenosiden. In MS(n)-Experimenten äußert sich das charakteristische Fragmentierungsverhalten der Ginsenoside in der sequentiellen Abspaltung der Zuckereinheiten in sukkzessiven Fragmentierungsschritten. Mit dieser Methode konnten die Zuckerketten an verschiedenen Positionen des Protopanaxadiol- bzw. Protopanaxatriolaglykons der Ginsenoside identifiziert, die glykosidischen Verknüpfungen innerhalb der einzelnen Zuckereinheiten durch spezifische Ringfragmente bestimmt und die genaue(n) Verknüpfungsposition(en) enzymatisch eingeführter Galaktose(n) lokalisiert werden. Bisher wurden allerdings Nano-ESI-MS/MS bzw. MS(n)-Untersuchungen primär an wässrigen oder organischen Lösungen von isolierten / aufgereinigten Stoffen oder Stoffgemischen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde erstmals diese Technik in der Bioanalytik zur Identifizierung von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und -urin angewandt. Obwohl die optimale Analytkonzentration für die Nano-Elektrosprayionisierung im allgemeinen bei 10-5M liegt, ist es gelungen, die Ginsenoside anhand ihrer spezifischen Fragmentionen im MS/MS Modus bis zu einer Konzentration von 2 ng/mL (10-8M) in biologischen Matrices nachzuweisen. Auch wenn die Molekülionenpeaks bei diesen geringen Konzentrationen im Rauschen untergehen, können die Ginsenoside durch selektive Isolierung der gewünschten Vorläuferionen und deren anschließende Fragmentierung in der Quadrupol-Ionenfalle auf der Basis der Detektion spezifischer Fragmente identifiziert werden. Da bei der Fragmentierung der gleichen Vorläuferionenmasse in Leerplasma bzw. Urin keine charakteristischen Fragmentionen gebildet werden, handelt es sich somit um einen spezifischen Nachweis der Ginsenoside in biologischen Matrices. Vor dem Hintergrund dieser vielversprechenden Vorversuche wurde eine Pilotstudie zum qualitativen Screening von Ginsenosiden und deren Metaboliten in Humanplasma und –urin durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß Protopanaxatriol-Ginsenoside sowohl im Magen hydrolysiert als auch intestinal degradiert werden. Schon in den ersten Stunden nach der einmaligen oralen Einnahme von Ginsana G115 Kapseln wurden die Hydrolyseprodukte G-Rh1 und hydratisiertes G-Rh1 in Humanplasma detektiert. Die schnelle Resorption dieser beiden Verbindungen aus dem oberen Gastrointestinaltrakt deutet auf die Hydrolyse des Ginsenosides Rg1 im Magen hin. Das spätere Auftreten eines weiteren monoglukosylierten Protopanaxatriols, des Degradationsproduktes G-F1, liefert den ersten In-Vivo-Hinweis auf einen intestinalen Metabolismus von Protopanaxatriol-Ginsenoside. Im Gegensatz zu den Protopanaxatriolginsenosiden passieren die Protopanaxadiol-Ginsenoside den Magen unverändert, wie aus der Abwesenheit jeglicher Protopanaxadiol-Degradationsprodukte im Plasma und Urin in den ersten Stunden nach der Applikation geschlossen werden kann. Erst im unteren Gastrointestinaltrakt werden Protopanaxadiol-Ginsenoside durch intestinale Bakterien zu „Compound-K“ abgebaut und anschließend resorbiert. Der Nachweis von Ginsenosid Rb1 im Plasma, sowie weiterer Ginsenoside im Urin eines Probanden zeigt, daß auch Ginsenoside in ihrer intakten Form resorbiert werden können. Dennoch sind weitere Studien hierzu notwendig, um zu klären, ob die Resorption intakter Ginsenoside die Regel oder eher eine Ausnahme darstellt. Mit der Identifizierung des Hydrolyseproduktes G-Rh1, der Degradationsprodukte G-F1 sowie „Compound-K“ in Humanplasma und -urin konnte schließlich die Frage geklärt werden, welche der zahlreichen in vitro bestimmten Degradationsprodukte tatsächlich den systemischen Kreislauf erreichen. Damit ist die Basis für eine spätere Quantifizierung dieser Verbindungen nach ihrer Isolierung bzw. Herstellung und Charakterisierung als Referenzsubstanzen geschaffen. Außerdem können diese neuen Erkenntnisse helfen, pharmakologische Ergebnisse aus In-vitro-Versuchen mit In-vivo-Daten besser zu korrelieren, da sie erste Hinweise geben, welche der in vitro getesteten Substanzen für die in vivo beobachteten Effekte verantwortlich sein könnten. Bisher wurde Nano-ESI-MS(n) in der Bioanalytik pflanzlicher Arzneistoffe nicht eingesetzt. In dieser Arbeit wurde diese Technik erstmals zum Screening von Ginsenosiden und deren Degradationsprodukte in Humanplasma und –urin benutzt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Nano-ESI-MS(n) auch eine empfindliche und sensitive Methode zur Identifizierung und zum Nachweis anderer medizinisch relevanter glykosidischer Verbindungen in biologischen Matrices darstellt, woraus sich neue Perspektiven für den Einsatz dieser Technik in der Metabolitenforschung sowie in der Bioanalytik pflanzlicher Xenobiotika ergeben. In den letzten Jahren rückte auch der Indische Weihrauch immer mehr in den Mittelpunkt des wissenschaftlichen sowie therapeutischen Interesses. Aufgrund der selektiven Hemmung der 5-Lipoxygenase gewinnen AKBA und KBA, als neue entzündungshemmende Verbindungen, zunehmend an Bedeutung. Während die quantitative Analytik der Boswelliasäuren in Extrakten und in verschiedenen Fertigarzneimitteln erhebliche Fortschritte erzielen konnte, fehlten auf dem Gebiet der Bioanalytik bislang validierte analytische Methoden zur Durchführung pharmakokinetischer Studien. Vor diesem Hintergrund wurde eine HPLC-Methode zur Bestimmung von KBA in Humanplasma entwickelt und validiert. Die Methode ist durch eine einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, die sich auf eine Festphasenextraktion der KBA aus der komplex zusammengesetzten biologischen Matrix beschränkt. Im Anschluß an die chromatographische Trennung auf einer RP-C18 Säule erfolgt die Quantifizierung der KBA mittels UV-Detektion bei 250 nm. Um eine adäquate Bestimmung der KBA in Humanplasma zu gewährleisten, wurde eine umfassende Validierung durchgeführt. Alle ermittelten Validierungsparameter, wie Spezifität, Linearität, Präzision, Richtigkeit, Reproduzierbarkeit, untere Quantifizierungsgrenze und Stabilität lagen innerhalb der vorgegebenen Grenzen. Damit erfüllt die entwickelte HPLC-Methode die allgemein gültigen Anforderungen an die Validierung bioanalytischer Methoden. Mit der Erstellung einer Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve im Rahmen einer ersten Pilotstudie konnte diese Methode zudem ihre praktische Anwendbarkeit unter Beweis stellen. Somit steht für zukünftige pharmakokinetische Studien eine validierte HPLC-Analytik zur Bestimmung von KBA, einer der Hauptwirkstoffe des Indischen Weihrauches, zur Verfügung, die sich durch hohe Spezifität, Reproduzierbarkeit und Präzision auszeichnet. Verlässliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen sind heute von besonderer Bedeutung, da sie helfen, die Dosierung zu optimieren, die biopharmazeutischen Eigenschaften von Präparaten zu verbessern und die Sicherheit bei der Anwendung zu erhöhen. Insbesondere im Hinblick auf bereits festgestellte Interaktionen von pflanzlichen Arzneimitteln mit Medikamenten reicht es nicht mehr aus, wenn sich pflanzliche Arzneimittel, wie beispielsweise Ginseng und Indischer Weihrauch, nur auf ihre langjährigen tradierten Anwendungserfahrungen berufen. So wird auch bei Phytopharmaka in verstärktem Maße eine wissenschaftliche Absicherung durch bioanalytische Forschung erwartet. Mit der Identifizierung der Ginsenoside und deren Degradationsprodukte im Menschen, der erstmaligen Anwendung von Nano-ESI-MS(n) in der Metabolitenforschung und der Entwicklung einer validierten bioanalytischen Methode zur Bestimmung der 11-Keto-Beta-Boswelliasäure in Humanplasma wurde diesen Erfordernissen Rechnung getragen.
• In terms of the widespread use of herbal remedies Panax ginseng and Boswellia serrata are gaining more and more scientific and therapeutic interest. Inspite of recent advances in the structural elucidation and analysis of their active ingredients in extracts as well as in pharmaceutical preparations bioanalytical studies are still sparse. So even though the metabolism of ginseng has been thoroughly studied in animals and in vitro using acids, enzymes and intestinal bacteria, knowledge concerning the metabolic fate of ginsenosides, considered to be the active ingredients of Panax ginseng, in humans is generally lacking. Thus it remains to be clarified if any of the various protopanaxatriol and protopanaxadiol ginsenosides can be absorbed from the human GIT and which of the previously in vitro determined metabolites reach the systemic circulation. Knowing about these active components is actually of great importance to understanding the clinical effects, preventing herb-drug interactions and optimizing the biopharmaceutical properties of ginseng preparations. Therefore the attention with regard to ginseng is focused on its metabolic pathway in humans. For the purpose of screening human plasma and urine for the presence of any ginsenosides and possible metabolites nano-ESI-MS(n), a sensetive and specific mass spectrometric method, was used. Nano-ESI in combination with collision induced dissociation (CID) in an ion trap has already revealed to be an efficient and rapid method for the structural analysis of ginsenosides. Due to the sequential elimination of both sugar moieties ginsenosides show a characteristic fragmentation pattern in MS(n) experiments. The high sensitivity of nano-ESI and the capability of carrying out several consecutive fragmentations in the ion trap allowed the identification of the carbohydrate moieties at different positions of the protopanaxadiol and protopanaxatriol aglycone, the linkage position within the sugar moieties and the exact point of attachment of enzymatically introduced galactose(s) in ginsenoside derivatives. Although the optimum analyte concentration for nano-ESI is generally known to be a 10-5 molar solution, ginsenosides could be detected in biological matrices up to 2 ng per mL (10-8M) by means of their characteristic fragment ions in the MS/MS modus. Of course the molecular ions of the ginsenosides in such low concentrations are not distinguishable from the background noise anymore, nevertheless they can be identified by the isolation of the corresponding precursor ion followed by its fragmentation in the ion trap. Furthermore the identification of the ginsenosides on the basis of their characteristic fragmentation ions in the MS/MS modus offers a substantial specificity advantage, since fragmentation of the same precursor ion mass in blank plasma or urine doesn´t yield these fragmentation ions. Within the scope of a pilot study the metabolic pathway of ginseng could be elucidated in humans after the oral adminstration of Ginsana G115, a commercial ginseng preparation. Both plasma and urine data were in good agreement with each other. The rapid absorption of the monoglucosylated protopanaxatriol Rh1 and hydrated Rh1, both hydrolysis products of ginsenoside Rg1, in the first hours after the oral administration from the upper part of the digestive tract indicates that ginsenoside Rg1 has been decomposed in the stomach. The later appearance of another monoglucosylated protopanaxatriol, metabolite F1, represents an in vivo evidence, that intestinal metabolism of protopanaxatriol ginsenosides also takes place in humans. As can be concluded from the absence of any metabolites of the protopanaxadiol group in the first hours following drug administration the protopanaxadiol ginsenosides are hardly decomposed in the gastric juice. Instead, the prolonged time needed for the appearance of compound-K, the main metabolite of the protopanaxadiol ginsenosides, shows that their absorption takes place in the lower part of the intestine after being hydrolysed by intestinal bacteria. The detection of ginsenoside Rb1 indicates that ginsenosides can also be absorbed in their intact form. However further studies are necessary to clarify whether the absorption of intact ginsenosides is the rule or rather an exception. In summary it was proven by the above results that two metabolites of the protopanaxatriol group, namely Rh1 and F1, in addition to compound-K, the metabolite of the protopanaxadiol ginsenosides are absorbed in humans. This insight into the biotransformation of ginseng in humans gives an idea of the metabolites actually reaching the systemic circulation and thus facilitates further quantification studies. In addition it helps better correlating pharmacological results from in vitro experiments with in vivo data, since it provides hints, which of the in vitro tested substances may be responsible for the effects observed in vivo. Within the framework of this dissertation nano-ESI-MS(n) was first used in the bioanalysis of herbal remedies to identify ginsenosides and their metabolites in human plasma and urine. Moreover it has been shown that nano-ESI-MS(n) can also be applied as a sensitive method for the identification of other glycosidic substances of medicinal relevance in biological matrices, opening thus another field of application for this technique in the metabolic research of herbal remedies. Also Boswellia serrata became the subject of intensive research in the last decades. In contrary to most herbal remedies, where the active constituents are not yet known, the active principles of Boswellia serrata have been identified as the boswellic acids. Being selective inhibitors of the 5-Lipoxygenase pathway 3-O-acetyl-11-keto-beta-boswellic acid (AKBA) and 11-keto-beta-boswellic acid (KBA) are gaining more and more importance as novel antiinflammatory compounds. Inspite of their therapeutic importance no validated analytical method existed up till now for the quantitative determination of boswellic acids in human matrices. Therefore a specific reversed phase high-performance liquid chromatographic (HPLC) method has been developed and validated for the determination of KBA in human plasma. This method is characterized by a simple sample preparation procedure, which is restricted on the introduction of a single solid-phase extraction step prior to the HPLC analysis of KBA. The method has been shown to provide good sensitivity, accuracy and precision. A validation procedure was performed according to current guidelines for bioanalytical method validation. All results obtained during the validation fulfill the requirements and recommendations generally accepted for bioanalytical studies. Furthermore the clinical suitability of this method was verified by monitoring the plasma concentration of KBA in a preliminary pilot study. In conclusion this method is suitable for the determination of KBA in future pharmacokinetic studies. As these studies can help to evaluate the optimal dose and to improve biopharmaceutical properties they are very essential in order to employ Boswellia serrata under the best conditions of efficacy and safety. Espescially with respect of recently observed drug-herb-interactions it is not sufficient anymore if herbal remedies just refer to their long traditional use. Therefore the demand for scientific confirmation of efficacy and safety of herbal remedies in humans is constantly increasing. With the elucidation of the metabolic pathway of ginsenosides in humans using nano- ESI-MS(n) for the first time in the metabolic research and developing a validated bioanalytical method for the determination of 11-keto-beta-boswellic acid in human plasma first steps have been made in this direction.