Open Access

Jessica Wohlgemuth

• Die N- und O-Glykosylierung von Proteinen ist gekennzeichnet durch eine hohe strukturelle und funktionelle Komplexität. Da verschiedene Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen selbst innerhalb eines Proteins unterschiedliche Aufgaben erfüllen können, ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Pharma-Industrie eine stellenspezifische Analytik zur Aufklärung der biologischen Bedeutung und bei therapeutischen Proteinen zur Gewährleistung von Sicherheit und gleichbleibenden pharmakologischen Eigenschaften essentiell. Die niedrige Abundanz sowie die hohe Komplexität durch die variablen Glykanzusammensetzungen und Verzweigungsmöglichkeiten sowie der daraus resultierende Mikroheterogenität an jeder einzelnen Stelle stellt jedoch eine besondere Herausforderung an die Analytik dar. In dieser Arbeit wurden deshalb auf verschiedenen Ebenen der Probenvorbereitung, der chromatographischen Separation sowie der MS-Analyse- Methoden und Techniken entwickelt und charakterisiert, um die stellenspezifische Analytik der Proteinglykosylierung zu vereinfachen. In einem ersten Schritt wurde die hohe Komplexität eines Glykoproteinverdaus reduziert. Es wurden verschiedene Methoden zur Glykopeptidanreicherung miteinander verglichen, wobei sich die HILIC-Festphasenextraktion unter optimierten Bedingungen durch eine sehr hohe Selektivität und Effizienz auszeichnete. Zur Methodenoptimierung wurden verschiedene HILIC-Materialien (Silika, Amino, Mikrokristalline Cellulose, TSKgel Amide-80 und ZIC®-HILIC) eingesetzt und durch eine Variation der Anreicherungsbedingungen die Hauptretentionsmechanismen für jedes Material beschrieben. TSKgel Amide-80 sowie ZIC®-HILIC sind am besten geeignet, da unter optimierten Bedingungen sekundäre Retentionsmechanismen wie elektrostatische Wechselwirkungen deutlich reduziert werden und die hydrophile Verteilung den Hauptretentionsmechanismus darstellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Parameter wie die Pufferzusammensetzung, Inkubationszeiten und die Volumenverhältnisse zwischen HILIC-Suspension, Binde-, Wasch- und Elutionspuffer entscheidend die Reproduzierbarkeit, Ausbeute und Selektivität beeinflussen. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen wurde ein Protokoll entwickelt, mit welchem Glykopeptide selektiv und quantitativ, d.h. ohne Präferenz für bestimmte Glykanstrukturen, aus komplexen Proben angereichert werden können. In Kombination mit Titandioxid zur selektiven Anreicherung sialylierter Glykopeptide bei bestimmten Fragestellungen ermöglichten in dieser Arbeit beide Methoden eine detaillierte Charakterisierung sowohl von N- als auch von O-Glykopeptiden. Die Hydrazinchemie erwies sich aufgrund eines zu komplexen Arbeitsschemas und einer unzureichenden Wiederfindung als nicht geeignet. Da je nach Aminosäuresequenz oft mit einer einzigen Protease (z.B. Trypsin) nicht alle Glykosylierungsstellen aufgrund ihrer Eigenschaften (z.B. Größe, Hydrophobizität) für die Anreicherung und LC-MS-Analyse zugänglich sind, kamen in dieser Arbeit weitere Proteasen zum Einsatz. Durch eine sequentielle Kombination von Trypsin mit Endoproteinase Glu-C bzw. Trypsin mit Chymotrypsin konnten in allen Proteinen sämtliche N-Glykosylierungsstellen nach einer Anreicherung identifiziert werden. Bei der Analyse von O-Glykopeptiden verbesserte zusätzlich die N-Deglykosylierung des intakten Proteins und die Abtrennung der freien N-Glykane mittels Ultrafiltration vor der Anreicherung die Analytik. Neben den bereits für die N-Glykopeptide beschriebenen Enzymkombinationen wurde außerdem Proteinase K eingesetzt, um die O-Glykopeptide z.B. von Fetuin effizient anzureichern und mittels LC-ESI-MS2/MS3 zu charakterisieren. Dies war mit einem Trypsinverdau alleine nicht möglich. Die Komplexität nach einer Glykopeptidanreicherung ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen immer noch so hoch, dass bei 1-dimensionalen HPLC-Läufen Koelution von Glykopeptiden zu einer unzureichenden Detektion niedrig-abundanter Formen führen kann. Aus diesem Grund wurden die komplementäre HPLC-Phasen RP18 und ZIC®-HILIC eingesetzt, um sich chromatographisch die differenzierenden Eigenschaften von Peptidgerüst und Glykanrest zunutze zu machen. ZIC®-HILIC ermöglicht die Auftrennung überwiegend nach der Glykanstruktur und RP18e nach Peptidsequenz und Anzahl an Sialinsäuren. Durch die Kombination beider Phasen in 1- und 2-dimensionalen HPLC-Konfigurationen konnten deutlich mehr unterschiedliche Glykoformen nachgewiesen und die Detektion niedrig-abundanter Glykopeptide ermöglicht werden, die bei der Verwendung von nur einer stationären Phase nicht identifiziert werden konnten. Zusammen mit einer komplementären MS-Analytik, die sowohl ESI als auch MALDI sowie unterschiedliche Fragmentierungstechniken wie CID, ETD, PSD oder CID-MS2/MS3 umfasste, konnten N- und O-Glykopeptide stellenspezifisch und vollständig sowohl mit ihrem Peptid- als auch mit ihrem Glykananteil charakterisiert werden. Für bestimmte quantitative Fragestellungen wurden außerdem die beschriebenen Anreicherungsmethoden mit dem zur Quantifizierung eingesetzten N-Glycan Mapping kombiniert und ein Arbeitschema entwickelt, mit welchem bei einem mehrfach glykosylierten Protein die Verhältnisse der unterschiedlichen Glykanstrukturen an den einzelnen Glykosylierungsstellen getrennt voneinander quantifiziert werden können. Mit jeder einzelnen, in dieser Arbeit beschriebenen Methode wird ein beträchtlicher Informationsgewinn erzielt, doch erst durch die Kombination einer effizienten Probenvorbereitung, einer komplementären HPLC-Separation, verschiedener MS/MS-Techniken und Methoden zur Quantifizierung kann die Glykosylierung eines komplexen Proteins stellenspezifisch und detailliert beschrieben werden.
• Protein N- and O-glycosylation is characterized by a high structural and functional complexity and even within one protein different glycan structures might fulfill versatile functions at different glycosylation sites. Therefore, site-specific analysis has become a very important issue for research as well as for pharmaceutical industry to reveal the biological significance of certain glycosylation patterns and to guarantee safety and unchanging pharmacological properties of therapeutic proteins. However, analysis is challenging due to the low abundance and the high complexity caused by variable glycan compositions and branching, isomeric forms and the micro-heterogeneity at each site. Therefore, methods and techniques at different levels – sample preparation, chromatography and mass spectrometry – have been developed and characterized in order to simplify and improve the site-specific analysis of protein glycosylation. Under optimized conditions HILIC-SPE turned out to be the best method for efficient glycopeptide enrichment. Different HILIC materials (silica, amino, microcrystalline cellulose, TSKgel Amide-80 and ZIC®-HILIC) were compared and the main retention mechanisms were elucidated for each material by variation of enrichment conditions. TSKgel Amide-80 as well as ZIC®-HILIC showed best performance, since under optimized conditions secondary retention mechanisms like electrostatic interactions could efficiently be reduced and controlled and hydrophilic partitioning had highest impact on glycopeptide retention. Furthermore the data demonstrated that parameters like buffer composition, incubation times and the volume ratios of HILIC-material, binding, wash and elution buffer significantly influences reproducibility, yield and selectivity. Taking all this observations into account a protocol was developed for an efficient enrichment of glycopeptides from complex samples without preference for specific glycan structures. It was quantitatively proved by N-glycan mapping that neither the ratio of the different glycans is shifted nor information gets lost during enrichment. In combination with titanium dioxide for the selective enrichment of sialylated glycopeptides in this work both methods facilitated a detailed characterization of N- and O-linked glycopeptides. Enrichment of N-linked glycopeptides by hydrazine chemistry proved to be unsuitable due to a very complex enrichment procedure and insufficient glycopeptide recovery. Depending on the amino acid sequence of a protein often not all glycosylation sites are accessible by enrichment and LC-MS analysis due to their properties like size or hydrophobicity. Using a sequential combination of trypsin and endoproteinase Glu-C or trypsin and chymotrypsin all glycosylation sites of each protein analyzed could be identified after HILIC-SPE enrichment. Concerning the enrichment of O-glycopeptides N-deglycosylation and removal of free glycans by ultrafiltration improved the analysis significantly. Besides the enzyme combinations described for N-glycopeptides Proteinase K turned out to work very efficiently for the digest and enrichment of fetuin O-glycopeptides, which could subsequently be characterized in detail by LC-ESI-MS2/MS3. This was not possible with a trypsin digest only. The complexity after glycopeptide enrichment might still be high due to different glycan structures and several glycosylation sites. Co-elution of peptides during a 1-dimensional chromatographic separation of the enriched sample might lead to ion suppression and insufficient detection of low-abundant glycoforms. Therefore, the complementary stationary phases RP18 and ZIC®-HILIC were employed to take advantage of the discriminating properties of peptide backbone and glycan residue. The retention behavior of glycopeptides was described under varied solvent conditions. ZIC®-HILIC facilitates separation mainly by glycan structure and RP18 by peptide sequence and degree of sialylation. With a combination of both phases in 1- and 2-dimensional HPLC-setups much more different glycoforms could be identified and detection of low abundant structures was enabled, which could not be identified when only one stationary phase was employed. In combination with complementary MS analysis using ESI- as well as MALDI and different fragmentation techniques like CID, ETD, PSD or CID-MS2/MS3 N- and O-glycopeptides could site-specifically and completely be characterized comprising both the peptide- and the glycan-moiety. Furthermore, in the case of multiple glycosylated proteins a procedure was developed to enable a site-specific quantitation of the glycosylation micro-heterogeneity at each specific site by a combination of glycopeptide enrichment and N-glycan mapping. In addition, TiO2 enrichment of N-glycans with subsequent N-glycan mapping enables the quantitation of only sialylated structures. Every individual method described in this work leads to a substantial gain in information. However, only the combination of efficient and selective sample preparation, complementary HPLC separation, different MS-techniques and methods for relative quantitation allows a site-specific and detailed characterization of protein glycosylation.