Open Access

Johannes Raphael Kupka

• Die Pathophysiologie der Bandscheibendegeneration (intervertebral disc degeneration, IVDD) und ihre molekularen Mechanismen sind noch in weiten Teilen unverstanden. Ihre Ursachen und Risikofaktoren sind vielfältig und schließen unter anderem Alter, Geschlecht, Umwelteinflüsse oder mechanische Belastungen mit ein. Für das der Bandscheibe eng verwandte Knorpelgewebe wurde in aktuellen Studien der Einfluss des Sympathikus bzw. dessen Neurotransmitters Noradrenalin (NE) via adrenerger Rezeptoren (AR) auf die Zellproliferation, die Expression von Molekülen der extrazellulären Matrix und somit auch auf die Degeneration beschrieben. In Bandscheiben wurde bereits das Vorhandensein von sympathischen Nervenendigungen nachgewiesen, allerdings wurde die Expression der Adrenozeptoren hier noch nie untersucht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war also die Analyse der ARs im Gewebe der Bandscheibe und die Evaluation der Korrelation mit der Bandscheibendegeneration. Das für die Analyse benötigte Gewebe stammt von Patienten, bei welchen eine Wirbelkörperverblockung (Spondylodese) durchgeführt wurde. Im Rahmen dieser Spondylodese wird das Bandscheibengewebe des betroffenen Segmentes entfernt. Der Degenerationsgrad der anonymisierten Proben wurde prä- und intraoperativ bestimmt und im entnommenen Gewebe sowie in isolierten Zellen die Expression aller bekannten ARs mittels reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) untersucht. Zum Nachweis der ARs auf Proteinebene wurden einzelne humane Proben auch immunhistochemisch analysiert. Des Weiteren wurde anhand von Wildtyp- und sogenannten SM/J-Mäusen, die eine spontane IVDD entwickeln, die Proteinexpression der ARs und der extrazellulären Matrix (ECM) von gesunden und geschädigten Bandscheiben an histologischen Schnitten verglichen. Schließlich wurde an isolierten und kultivierten humanen Zellen ein Stimulationsversuch mit Noradrenalin durchgeführt, um zu prüfen, ob es nach Aktivierung der ARs zu einer intrazellulären Signalweiterleitung kommt. In Nativgewebe der humanen Bandscheibe konnte die messenger Ribonukleinsäure (mRNA) von α1a-, α1b-, α2a-, α2b-, α2c-, β1- und β2-ARs nachgewiesen werden. Nach siebentägiger Zellkultur im Monolayer präsentierte sich ein nur dezent abweichendes Genexpressionsmuster. Auf Proteinebene war das Signal des β2-AR nur im Bereich des Annulus fibrosus (AF) detektierbar jedoch nicht im Nucleus pulposus (NP). Selbiges war auch in murinen Schnitten festzustellen, wobei sich bei Wildtype (WT)-Mäusen hauptsächlich im inneren AF β2-positive Zellen fanden, während sich das Signal bei der SM/J-Maus weiter in Richtung des äußeren AF und des NP ausdehnte. α2a-AR und α2c-AR waren hingegen auf Proteinebene nicht nachweisbar. Bei der immunhistochemischen Untersuchung relevanter ECM-Moleküle zeigte sich für Kollagen II, Kollagen XII, cartilage oligomeric matrix protein (COMP) und Decorin (DCN) eine Verteilung, die mit der des β2-AR-Signals korreliert. Der Stimulationsversuch in humaner Zellkultur ergab eine Aktivierung der für die ARs relevanten Proteinkinase A (PKA)- und extracellular signal–regulated kinases (ERK1/2) -Signalwege. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal die Existenz und Funktionalität von Adrenozeptoren im Bandscheibengewebe nachgewiesen werden. Unterschiede in der Expression der ARs, kombiniert mit Veränderungen der ECM-Zusammensetzung könnten ein Hinweis auf den Einfluss des Sympathikus bei IVDD sein. Die aktuelle demographische Entwicklung und die sich hieraus ergebende gesundheitsökonomische Belastung machen die Ergründung molekularer Mechanismen der IVDD und die daraus resultierende Entwicklung innovativer Behandlungsmethoden zu Kardinalfragen moderner orthopädischer Grundlagenforschung.
• The pathophysiology of the intervertebral disc degeneration and its molecular mechanisms are still not sufficiently understood. Well known causes and risk factors are age, gender, environmental influences and mechanical loading. Recently, the impact of the sympathetic nervous system and its neurotransmitter norepinephrine on cell proliferation, expression of extracellular matrix proteins and, therefore, also on the degeneration of articular cartilage was described. Although it is already known that the IVD is innervated by sympathetic nerve fibres, the existence of adrenergic receptors has not been investigated. Thus, the aim of the present study was the analysis of ARs in IVD tissue and their influence on the IVDD. The analysed IVD tissue originates from patients undergoing spinal fusion (spondylodesis). During this surgery, the IVD of the affected segment is removed. The degree of degeneration was determined pre- and intraoperatively in anonymised samples. Both, isolated and cultured cells as well as native tissue were analysed by reverse transcription polymerase chain reaction to investigate the gene expression of all known ARs. Immunohistochemistry was used to detect ARs on the protein level. Furthermore, the protein expression of ARs and main components of the ECM were evaluated in spine sections of wildtype and SM/Jmice – a mouse line, which develops an early spontaneous disc degeneration. This model made it possible to compare healthy and degenerated IVDs. Finally, a stimulation experiment with norepinephrine was performed on the above-mentioned human cells. In native tissue, the mRNA of α1a-, α1b-, α2a-, α2b-, α2c-, β1- and β2-ARs could be detected. After seven days of monolayer cell culture, IVD cells showed an only slightly different gene expression pattern. In human IVDs, β2-AR was detectable on the protein-level in the annulus fibrosus, however, no signal was visible in the nucleus pulposus. The same also applies to murine sections: in wildtype mice β2-positive cells were restricted to the inner AF while in SM/J-mice the signal was more widespread towards the outer parts and the NP. α2a- and α2c-AR were not detected in any of the samples. The staining of selected molecules of the ECM revealed that the distribution of collagen II, collagen XII, COMP and decorin correlated with the expression of β2-AR. An activation of the PKA- and ERK1/2-signalling pathways could be observed after stimulation with NE in human IVD cells. In the present study, the existence and functionality of ARs in IVD-tissue was demonstrated for the first time. Differences in the AR-expression combined with changes in the extracellular matrix composition suggest that the sympathetic nervous system might play a role in IVDD. The current demographic trend and the evoked economic burden underline the importance of further investigations on molecular mechanisms and of the resulting development of novel therapy options for the treatment of IVDD. Thereby, these issues are and remain key topics of modern orthopaedic fundamental research.