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Yasmin El-Nahry

• In Deutschland erkranken pro Jahr bis zu 12.000 Menschen neu an Leukämie. Leukämie ist eine schwere onkologische Erkrankung, bei der reifes Knochenmarkgewebe in Folge von Mutationen unreifer und defekter Vorläuferzellen (leukämischen Blasten) verdrängt wird. Dies führt zu einer zunehmend eingeschränkten Blutbildung. Akute Leukämieformen können unbehandelt innerhalb von wenigen Wochen zum Tode führen und erfordern deshalb eine umgehende Diagnostik sowie einen raschen Therapiebeginn. Heilungschancen bestehen dann, wenn durch die Transplantation von gesunden hämatopoetischen Stammzellen (HSZT) das erkrankte Knochenmark ausreichend ersetzt wird. Leider sind Abstoßungsreaktionen des Spendermaterials (engl.: Graft-versus-Host-Disease, GvHD) keine Seltenheit. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) stellen die kleinste Lymphozytenpopulation im menschlichen Blut dar und werden dem angeborenen Immunsystem zugerechnet. Sie wurden erstmals 1975 durch die Forscher Kiessling, Klein et al. entdeckt.17 Aufgrund ihrer Fähigkeit bestimmte Tumorzellen in vitro zu töten, wächst das Interesse an der Erforschung ihrer aktivierenden und inhibierenden Oberflächenrezeptoren. Die Killer-Zell-Immunoglobulin-ähnlichen Rezeptoren (KIRs) bilden dabei eine besonders diverse NKZell-Rezeptorfamilie. Lokalisiert auf Chromosom 19 liegen bis zu 17 hochpolymorphe KIRGene. Die genetische Ausstattung und Oberflächenexpression variiert von Individuum zu Individuum und bildet die Voraussetzung für die vorhandene Diversität KIR-exprimierender NK-Zellen. NK-Zellen besitzen die Fähigkeit, Gewebezellen in „körpereigen“ oder „fremd“ zu kategorisieren. Inhibitorische Killer-Immunoglobulin-ähnliche Rezeptoren (iKIR) nutzen dazu HLA-Klasse-I-Proteine (MHC-I) auf der Oberfläche gesunder Zellen. Diese schützen sie vor einem zytotoxischen NK-Zell-Angriff. NK-Zellen durchlaufen im Vorfeld einen komplexen Ausbildungssprozess48, an dessen Ende lizensierte Effektorzellen stehen. Diese können mittels gezielter Zytolyse krebstransformierte, zellulär-gestresste, sowie viralinfizierte Zellen im intakten Organismus erkennen und abtöten. Die Spenderauswahl ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg einer Stammzelltransplantation. Infundierte Spender NK-Zellen schützen das Transplantat, indem sie als wirksame Effektorzellen verbleibende Leukämiezellen aktiv eliminieren. Diese wünschenswerte Nebenwirkung wird als Graft-versus-Leukämie (GvL)-Effekt bezeichnet. Ruggeri et al. konnte zeigen, dass insbesondere Transplantationsstrategien, die auf KIR-Ligand-Fehlpaarungen (engl.: KIR-HLA-mismatch) basieren, zu weniger Rückfällen, weniger GvHD und einem besseren Gesamtüberleben bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach HSZT führt. Der KIR-HLA-mismatch wird mittlerweile aufgrund ausreichender Datenlage bei der Auswahl passender NK-Zell-Spender berücksichtigt und die Untersuchung auf die An- bzw. Abwesenheit bestimmter KIR-Gene (Haplotypisierung) mittlerweile neben der HLA-Typisierung standardisiert in vielen Instituten durchgeführt. Daneben finden sich immer mehr Hinweise dafür, dass bereits einzelne allelische Polymorphismen innerhalb der KIR-Gene einzelner Spender großen Einfluss auf die Funktionalität ihrer NK-Zellen nehmen. Die allelische Subtypisierung von KIRs stellt aufgrund stetig steigender Zahlen neu entdeckter Allele eine Herausforderung dar. Im Januar 2019 sind für KIR2DL1 bereits 66 Allele beschrieben und für KIR3DL1 sogar 150 Allele in der Immuno Polymorphism Database (IPD) hinterlegt. Die vorliegende Arbeit präsentiert ein praktikables Subtypisierungsverfahren, um allelische Unterschiede innerhalb der Genloci der NK-Zell-Rezeptoren KIR2DL1 und KIR3DL1 zu untersuchen. Für die Experimente wurden NK-Zellen von 20 gesunden Spendern funktionell untersucht und KIR-genetisch analysiert. Ziel war es innerhalb dieser Individuen besonders potente NK-Zellspender zu identifizieren und diese anhand bestimmter Polymorphismen und/ oder der Expression von KIR-Rezeptoren zu charakterisieren. Bei der Subtypisierung der KIR2DL1-Gene konnten 12 verschiedene, bereits bekannte KIR2DL1-Allele bestimmt werden. Die häufigsten Allele waren dabei 2DL1*001, *00201, *00302, *00401 und *00403. 5 der 20 Spender konnten der funktionell hochpotenten R245–Allelgruppe (AS Arginin an Pos. 245) zugeordnet werden. Spender 13 zeigte bei negativer KIR2DL1-SSP eine vermeintlich neue Nullallelvariante, Spender 20 eine neue heterozygote Variante, resultierend in der Kombination eines Arginin mit Alanin (R/A). Bei der allelischer Subtypisierung von KIR3DL1 wurden 25 verschiedene, bereits bekannte KIR3DL1-Allele bei den 20 Spendern bestimmt. Spender 2 zeigt zahlreiche, vorwiegend homozygote Abweichungen von der Referenzfrequenz, insbesondere im Exon 5, und wurde als neue Allelvariante gewertet. Die häufigsten KIR3DL1-Allele waren 3DL1*00101, *002 und *087. Mittels durchflusszytometrischer Messung konnte gezeigt werden, dass das bekannte Nullallel 3DL1*0040101 bei Spender 14 zu keiner Oberflächenexpression des Rezeptors führt215, während Spendern 11 und 16 als Träger des 3DL1*00402 Allels eine Oberflächenexpression von rund 10% präsentierten. Um die Spender NK-Zellen der gebildeten Gruppen funktionell zu testen, wurden die NK-Zellen experimentell mit vier unterschiedlichen transgenen L721.221-Zelllinien stimuliert. Die funktionelle Potenz der gespendeten NK-Zellen wurde mittels eines CD107-Degranulationsassays gemessen. Nach aktuellem Stand sind nur für 53 der 150 KIR3DL1-Allele die allelischen Expressionsmuster untersucht worden. Dies bedeutet im Umkehrschluss, dass für rund 65% der bekannten KIR3DL1-Allele Daten zur Funktionalität fehlen, und damit der größte Anteil der ermittelten Allele von 6 Spendern der unknown-Expression (KIR3DL1u/u) Gruppe zugeordnet wurde. Die Spender 4 und 19 der high-Expressiongruppe (KIR3DL1h/h), sowie Spender 5 und 10 der KIR3DL1u/u-Gruppe mit den Allelen 3DL1*053, *087, *109 und Spender 2 als Träger zweier neuer KIR3DL1-Allele, zeigten in toto die besten funktionellen Ergebnisse in den Experimenten gegen die verwendete B-lymphoblastoide L721.221-Zellinien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass bei der Spenderauswahl für NK-Zellbasierten Immuntherapie neben der Genotypisierung die allelische KIR-Subtypisierung als wertvolles Werkzeug entschiedener berücksichtigt werden sollte. Dafür ist es jedoch notwendig weiter an KIR-Subtypisierung und -Gruppierung Strategien zu arbeiten, um Natürlichen Killerzellen Wege in die klinische Standardpraxis zu bahnen.
• In Germany, the annual prevalence of leukemia is around 12.000 individuals. Leukemia is a serious oncological disease, in which mature bone marrow tissue mutates and is displaced by immature and dysfunctional progenitor cells (leukemic blasts). This leads to increasingly restricted blood formation. Acute forms of leukemia, if left untreated, can lead to death within a few weeks and therefore require immediate diagnostics and a swift therapy. Chances of recovery exist if the affected bone marrow is adequately replaced after the transplantation of healthy hematopoietic stem cells (HSCT). Unfortunately, rejection reactions of the donor material (Graft-versus-Host Disease, GvHD) remain quite common. Natural killer cells represent the smallest lymphocyte population in human blood and form part of the innate immune system. They were first discovered in 1975 by Kiessling, Klein et al. Due to their ability to kill certain cancer cells in vitro, there has been increasing interest in researching their activating and inhibiting surface receptors. The killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR) form a particularly diverse NK cell receptor family. Up to 17 highly polymorphic KIR genes are located on chromosome 19. The genetic manifestation and surface expression varies from individual to individual and is the prerequisite for the diversity of KIR-expressing NK cells. NK cells have the ability to categorize tissue into endogenous or foreign cells. Inhibitory killer immunoglobulin-like receptors (iKIR) use HLA class I proteins (MHC-I) on the surface of healthy cells to do so. These protect healthy cells from a cytotoxic NK cell attack. In order to develop the ability to differentiate, NK cells undergo a complex process of education. At its end there are licensed effector cells that can detect and kill cancer-transformed, cellular-stressed and virusinfected cells in the intact organism by means of targeted cytolysis. Donor selection is an important factor in the success of a stem cell transplant. Infused donor NK cells protect the graft by actively eliminating remaining leukemia cells. That desirable side effect is known as the Graft-versus-Leukemia (GvL) effect. Ruggeri et al. were able to show that transplant strategies based on KIR ligand mismatches in particular lead to fewer relapses, less GvHD and better overall survival in patients with acute myeloid leukemia (AML) after HSCT. For this reason and due to sufficient data the KIR-HLA mismatch is now taken into account in the selection of suitable NK cell donors and KIR genotyping, in addition to HLA typing, has become a standardized procedure in many institutes. In addition, there is growing evidence that individual allelic polymorphisms within the KIR genes of individual donors have a major influence on the functionality of their NK cells. The allelic subtyping of KIRs is a challenge due to ever-increasing numbers of newly discovered alleles. In January 2019, 66 alleles have already been described for KIR2DL1 and up to 150 alleles for KIR3DL1 are stored in the Immuno Polymorphism Database (IPD). The present work presents a clinically suitable subtyping method to investigate allelic differences within the gene loci of the KIR receptors 2DL1 and 3DL1. For experimental purpose NK cells from 20 healthy individuals were functionally examined and genetically analysed for KIR. The main aim of the study was to identify particularly potent NK cell donors within all individuals and to characterize them on the basis of certain polymorphisms and/or expression of KIR receptors. When subtyping the KIR2DL1 genes 12 different, already known KIR2DL1 alleles were determined. The most common alleles within them were 2DL1 *001, *00201, *00302, *00401 and *00403. 5 of the 20 donors could be assigned to the functionally highly potent R245 allele group (AS arginine at position 245). Donor 13 showed a supposedly new null allele variant with negative KIR2DL1-SSP, donor 20 showed a new heterozygous variant, resulting in the combination of an arginine with alanine (R/A245). In the allelic subtyping of KIR3DL1, 25 different, already known KIR3DL1 alleles were determined from the 20 donors. Donor 2 showed numerous, predominantly homozygous deviations from the reference frequency, especially in exon 5, and was rated as a new allele variation. The most common KIR3DL1 alleles were 3DL1 *00101, *002 and *087. Flow cytometric measurements showed that the well-known null allele 3DL1 *0040101 in donor 14 did not lead to any surface expression of the receptor215, while donors 11 and 16 carrying the allele 3DL1 *00402 presented a surface expression around 10%. In order to functionally test the grouped donor NK cells they were experimentally stimulated with four different transgenic L721.221 cell lines that had different MHC characteristics (see section 3.2.1). The functional potency of the donated NK cells was measured using a CD107 degranulation assay. According to the current status of KIR3DL1 alleles only 53 of the 150 known alleles have been examined for allelic expression patterns. Conversely, this means that there is hardly any data for around 65% of the other known KIR3DL1 alleles. Consequently, the majority of identified alleles were counted as unknown expression (KIR3DL1u/u). Donors 4 and 19 of the high expression group (KIR3DL1h/ h), as well as donors 5 and 10 of the KIR3DL1u/u group carrying the alleles 3DL1*053, *087, *109 and donor 2 showing two new KIR3DL1 alleles, in toto showed the best functional results in the experiments against Blymphoblastoid L721.221 cell lines. The results show that allelic KIR subtyping of donors is a valuable tool in addition to genotyping. Therefore it should be given greater consideration in the selection of NK cell donors in the future. However, it is necessary to continue investigating in KIR subtyping and grouping strategies in order to further open ways for natural killer cells into standard clinical practice.