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Valeska Simon

• Zytolysin A (ClyA) von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von bakteriellen porenbildenden Zytolysinen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren bildet, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Das Strukturgen des ClyA-Proteins, clyA, wurde ursprünglich im Chromosom des E. coli-Laborstammes K-12 identifiziert, später wurde es aber auch im Genom von vielen E. coli-Stämmen gefunden, die intestinale Infektionen beim Menschen verursachen (insbesondere in enteroinvasiven, Shigatoxin-produzierenden, enteroaggregativen und enterotoxischen E. coli-Stämmen). Die Expression des clyA-Gens unterliegt einer komplexen Regulation; unter normalen in vitro-Kulturbedingungen ist das clyA-Gen in E. coli stark reprimiert. In mehreren Salmonella enterica Serovar Typhi-Stämmen und in einem S. enterica Serovar Paratyphi A-Stamm (ATCC 9150) wurden kürzlich funktionale (intakte) clyA-homologe Gene gefunden, deren Proteinprodukte 90-91% Aminosäuresequenzidentität zu ClyA von E. coli aufweisen. Im Genom eines aviären (vogelpathogenen) E. coli-Stammes wurde ein intaktes clyA-homologes Hämolysingen identifiziert, dessen Proteinprodukt ca. 75% Identität zu ClyA von E. coli K-12 und anderen E. coli-Stämmen zeigt. Auch in mehreren Shigella flexneri-Stämmen sowie in einem Shigella sonnei- und einem Shigella dysenteriae-Stamm wurden clyA-homologe DNA-Sequenzen nachgewiesen. Alle bisher untersuchten Shigella-Stämme enthalten jedoch nur ein defektes clyA-Gen: in den untersuchten Sh. flexneri-Stämmen weist das clyA-Gen eine identische 11 bp-Deletion auf, welche aufgrund der entsprechenden Leserasterverschiebung zu einem vorzeitigen Abbruch der kodierenden Sequenz führt; in dem untersuchten Sh. sonnei-Stamm ST3112/01 ist das clyA-Gen durch ein Insertionselement (IS1 von Sh. sonnei) unterbrochen; und in dem untersuchten Sh. dysenteriae-Stamm ist ein großer Teil des clyA-Gens deletiert und durch ein IS-Element (iso-IS1 von Sh. dysenteriae) ersetzt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei weitere Sh. sonnei-Stämme, ein weiterer S. enterica Serovar Paratyphi A-Stamm sowie verschiedene andere Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae hinsichtlich des Vorhandenseins von clyA bzw. von clyA-homologen DNA-Sequenzen untersucht. Aus den beiden Sh. sonnei-Stämmen ST2757/01 und ST3135/01 und aus dem S. enterica Serovar Paratyphi A-Stamm FR1/99 konnten durch PCR clyA-spezifische DNA-Fragmente amplifiziert werden. Die Sequenzierung des clyA-spezifischen PCR-Produktes von S. enterica Serovar Paratyphi A FR1/99 zeigte, dass dieser Stamm ein intaktes clyA-Gen enthält, welches einschließlich der flankierenden DNA-Sequenzen 100% Nukleotidsequenzidentität zum clyA-Gen des Serovar Paratyphi A-Stammes ATCC 9150 aufweist. Um die Promotorregion dieses clyA-Gens (clyAS. enterica Serovar ParatyphiA) einzugrenzen, wurde es mit unterschiedlich langen 5'-flankierenden DNA-Sequenzen amplifiziert und in den Plasmidvektor pUC18 kloniert. Plasmidkonstrukte, die stromaufwärts vom clyAS. enterica Serovar ParatyphiA-Gen die ersten 102 bzw. 128 5'-flankierenden Basenpaare enthielten, führten nach Transformation in einen E. coli-Laborstamm (E. coli K-12-Derivat DH5a) zu einem ähnlich starken hämolytischen Phänotyp, während ein isogenes Plasmidkonstrukt mit 471 bp 5'-flankierender DNA-Sequenz deutlich schwächere hämolytische Aktivität vermittelte. Innerhalb der ersten 102 bp stromaufwärts vom clyAS.enterica Serovar ParatyphiA -Startcodon scheinen demnach regulatorische Sequenzen zu liegen, die die Expression dieses Gens gestatten, während DNA-Sequenzen, die mehr als 128 bp vor dem ATG-Startcodon liegen, die Expression anscheinend eher behindern. Die von Sh. sonnei ST2757/01 und Sh. sonnei ST3135/01 erhaltenen clyA-spezifischen PCRProdukte zeigten identische Größen; es wurde deshalb nur mit einem der beiden Stämme (ST2757/01) weitergearbeitet. Eine DNA-Sequenzanalyse ergab, dass Sh. sonnei ST2757/01 ein clyA-Gen enthält, welches an zwei Stellen (zwischen Nukleotidposition 80 und 81 und zwischen Nukleotidposition 354 und 355 von clyA) durch IS1 von Sh. sonnei unterbrochen ist. Die hintere der beiden IS1-Insertionen war dabei identisch mit der IS1-Insertion, die im clyA-Gen des bereits früher untersuchten Sh. sonnei-Stammes (ST3112/01) nachgewiesen worden war. Aus Stämmen der Species Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter gillenii, Citrobacter murliniae, Citrobacter braakii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Yersinia enterocolitica, Proteus mirabilis und Morganella morganii konnten durch PCR keine clyA-homologen DNA-Sequenzen amplifiziert werden. Da auch in Southern Blot-Analysen mit einer clyA-spezifischen, 712 bp großen Gensonde keiner dieser Stämme eine signifikant positive Reaktion zeigte, wurde gefolgert, dass diese Stämme kein clyA-Gen und keine clyA-ähnlichen Sequenzen besitzen. Es spricht somit einiges dafür, dass das Zytolysingen clyA innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae nur in den Gattungen Escherichia, Salmonella und Shigella vorkommt.
• Cytolysin A (ClyA) of Escherichia coli is a novel cytolysin with little apparent resemblance to previously characterized cytolysins. It is the prototype of a new family of pore-forming bacterial toxins. ClyA is a hemolytic and cytotoxic 34 kDa protein which forms stable pores in cell membranes by assembling to ring-shaped oligomers. The gene encoding the ClyA protein, clyA, was first identified in E. coli K-12, a laboratory strain. Later, it was also found in many E. coli strains causing intestinal infections in humans (particularly in enteroinvasive, Shiga toxin-producing, enteroaggregative and enterotoxic E. coli strains). The expression of clyA is controlled by a complex regulation system; under normal laboratory conditions the gene is strongly repressed. Recently, clyA homologues were identified in several Salmonella enterica serovar Typhi strains and in an S. enterica serovar Paratyphi A strain (strain ATCC 9150). The ClyA proteins encoded by these clyA homologues show 90-91% identity in amino acid sequence to ClyA of E. coli. In the genome of an avian E. coli strain, an intact clyA gene was found whose protein product is 75% identical in amino acid sequence to E. coli ClyA. Furthermore, clyAhomologous genes were identified in Shigella strains. However, in all Shigella strains analyzed so far, clyA is obviously nonfunctional: in several tested S. flexneri strains, clyA shows an 11-bp deletion leading to a frameshift with premature truncation of the gene sequence; in a tested Sh. sonnei strain, clyA is interrupted by an insertion sequence (IS1 of Sh. sonnei); and in a tested Sh. dysenteriae strain, a large part of clyA is deleted and replaced by an insertion sequence (iso-IS1 of Sh. dysenteriae). In this work, two additional Sh. sonnei strains, another S. enterica serovar Paratyphi A strain and several other bacteria belonging to the Enterobacteriaceae were examined with regard to the presence and integrity of the clyA-gene or of clyA-homologous DNA-sequences. From the Sh. sonnei strains (ST2757/01 and ST3135/01) and from S. enterica serovar Paratyphi A strain FR1/99 clyA-homologous sequences could be amplified by PCR. Sequencing of the PCR product obtained from S. enterica serovar Paratyphi A FR1/99 showed that this strain harbors an intact clyA gene which is 100% identical in nucleotide sequence to clyA of S. enterica serovar Paratyphi A ATCC 9150. To identify the promoter region of this clyA gene, it was amplified with different long fragments of the 5'-flanking DNA-sequence and cloned into the plasmid vector pUC18. Plasmid constructs containing the first 102 and 128 basepairs, respectively, upstream from clyA of S. enterica serovar Paratyphi A caused a similar hemolytic phenotype when transformed into the E. coli laboratory strain DH5a, while an isogenic plasmid construct containing 471 bp of the 5'-flanking DNA sequence caused only weaker hemolytic activity. Thus, regulatory sequences permitting gene expression appear to be present within the first 102 bp upstream from clyA of S.enterica serovar Paratyphi A, while DNA sequences located more than 128 bp upstream from the clyA startcodon obviously inhibit gene expression. The clyA-specific PCR products obtained from Sh. sonnei ST2757/01 and Sh. sonnei ST3135/01 were identical in size. Therefore, only one of these strains (ST2757/01) was further studied. DNA sequence analyses showed that Sh. sonnei ST2757/01 harbors a clyA gene which is interrupted twice by IS1 of Sh. sonnei (between nucleotide position 80 and 81 and between position 354 and 355 of clyA). The IS1 insertion at nucleotide position 354-355 proved to be identical to the single IS1 insertion that was previously found in the clyA gene of another Sh. sonnei (strain ST3112/01). From strains of the species Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter gillenii, Citrobacter murliniae, Citrobacter braakii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Yersinia enterocolitica, Proteus mirabilis and Morganella morganii, no clyA-homologous DNA sequences could be amplified by PCR. Furthermore, in Southern blot analyses conducted with a 712-bp clyA gene probe, none of these strains showed a significant positive reactivity. It can therefore be concluded that these strains do not harbor clyA-related DNA sequences. Thus, one may speculate that the cytolysin gene clyA is only found in Escherichia, Salmonella and Shigella species.