Open Access

Stefan Löckermann

• Die Hämophilie A stellt die häufigste angeborene Koagulopathie dar. Ursache der Hämophilie A ist die fehlende oder verminderte Aktivität des Faktor VIII (FVIII)-Proteins, das eine zentrale Rolle im plasmatischen Gerinnungssystem spielt. Antikörper (Inhibitoren) vermittelte Reaktionen, die die Funktion des Gerinnungsfaktors VIII inhibieren können, stellen eine ernstzunehmende Komplikation bei der Substitutionstherapie von Hämophilie A Patienten dar. Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, die komplexen immunologischen Mechanismen einer Inhibitorbildung auf Ebene der T-Helferzellen im hämophilen Mausmodell genauer zu untersuchen. Insbesondere sollte untersucht werden, ob sich immunogene T-Zellepitope des humanen FVIII-Proteins identifizieren lassen, die für die Ausbildung einer T-Helferzellantwort und damit letztlich für eine Antikörperbildung gegen FVIII verantwortlich sein könnten. Hierzu wurden FVIII-KO-Mäuse intraperitoneal und intravenös mit FVIII-Protein immunisiert und die T-Zellantwort isolierter Milz-T-Helferzellen gegen FVIII-Gesamtprotein sowie ein Panel aus 240 synthetisch hergestellten 15mer Peptiden immunogener Regionen (a1: AS 320-405, A2: AS 460-595, a3: AS 1630-1715, A3: AS 1790-1845, C1-C2: AS 1977-2332) des FVIII-Proteins untersucht. Es zeigte sich, dass FVIII-KO-Mäuse unter den genannten Bedingungen vorrangig eine TH1-Antwort (IFN-gamma) ausprägen. Die Frequenz FVIII-spezifischer T-Helferzellen liegt hierbei im Mittel bei 44 FVIII spezifischen CD4+-Zellen/105 T-Helferzellen. Eine weitere Steigerung der zur Restimulation eingesetzten FVIII-Dosis auf 10 mikro g/ml führte interessanterweise zu einer Abschwächung der T-Zellantwort (11 CD4+-Zellen/105 T-Helferzellen). Die Untersuchung der Spezifität der T-Zellantwort durch Restimulation mit FVIII-Peptidpools der einzelnen Regionen des FVIII Proteins ergab zunächst eine vergleichbar starke T-Zellantwort gegen alle eingesetzten FVIII-Peptidpools (24 FVIII-spezifische CD4+-Zellen/105 T-Helferzellen). Eine weiterführende Auflösung der Peptidpools mit anschließender Untersuchung der T-Zellspezifität gegen die einzelnen 240 FVIII-Peptide ergab, dass die T-Helferzellen immunisierter FVIII-KO-Mäuse gegen alle Peptide gleichermaßen reagierten (Frequenz von im Mittel 47 FVIII-spezifische CD4+-Zellen/105 CD4+-T-Zellen), nicht aber gegen ein mitgeführtes irrelevantes Kontrollantigen Ova323-339. Hämophile Mäuse, die mit humanem FVIII-Protein immunisiert wurden, scheinen demnach eine T-Zellantwort auszubilden, wie sie der von gesunden Probanden entspricht, bei denen ebenfalls T-Zellen gegen eine Vielzahl verschiedener FVIII Peptide nachgewiesen werden konnten (Reding et al., 2004). Diese klinisch irrelevanten T-Zellklone werden im Rahmen der Ausbildung einer spezifisch gegen FVIII gerichteten T-Zellantwort bei Hämophilie A-Patienten möglicherweise herunterreguliert, so dass T-Zellklone gegen individuelle klinisch relevante Epitope prädominieren (Reding et al., 2004).
• Haemophilia A is the most common congenital coagulopathy caused by deficiency or reduced activity of the factor VIII (FVIII) protein, which plays a central role in the plasma coagulation system. Antibody-(inhibitor) mediated reactions can inhibit the function of clotting FVIII and are a serious complication in the substitution therapy of haemophilia patients. The aim of this study was to specify the complex immunologic mechanisms of inhibitor formation on T helper cell level in a haemophilic mouse model. In particular it should be examined whether the immunologic T cell epitopes are identified for the formation of a T cell response and are therefore responsible for antibody synthesis against FVIII. To test this, FVIII knock out mice were immunized intraperitoneally and intravenously with FVIII protein and the T cell answer of isolated spleen T helper cells against the complete FVIII protein and a panel of 240 synthetically produced, overlapping FVIII-15mer peptides of immunologic regions (a1: AS 320-405, A2: AS 460-595, a3: AS 1630-1715, A3: AS 1790-1845, C1-C2: AS 1977-2332) was analysed. Under these conditions, it was shown that FVIII knock out mice preferential developed a TH1 response (IFN-gamma). The frequency of FVIII specific T helper cells was in average 44 FVIII specific CD4+ cells per 100.000 T helper cells. Interestingly, further restimulation with higher FVIII concentrations up to 10 micro g/ml FVIII down-regulated the T cell response to 11 specific CD4+ cells per 100.000 T helper cells. The analysis of T cell response specifity by restimulation with FVIII peptide pools of single regions of the FVIII protein showed initially a comparable vigorous T cell response against all tested FVIII peptide pools (24 FVIII specific CD4+ cells per 100.000 T helper cells). A further release of peptide pools with following analysis of T cell specificity against the 240 single FVIII peptides showed that T helper cells of immunized FVIII knock out mice reacted against all peptides in the same manner (frequency with an average of 47 FVIII specific CD4+ T cells per 100.000 CD+ T cells) but not against an immunologically irrelevant, control antigen (Ova323-339). Human FVIII protein immunized haemophilia mice develop a T cell response comparable to healthy subjects. In healthy subjects, T cells against a range of several FVIII peptides were also detected. In haemophilia A patients, these clinically irrelevant T cell clones are possibly down-regulated in context of formation of a specific T cell response against FVIII, with predominance of T cell clones against individual clinically relevant epitopes.