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Torsten Däubner

• Das humane Cytomegalovirus (hCMV) ist ein ubiquitär verbreitetes Pathogen. Die CMV-Infektion ist eine nicht selten lebensbedrohliche Komplikation bei immunsupprimierten Organ- und Knochenmarktransplantat-Empfängern. Bei immunkompetenten Individuen hingegen verläuft eine CMV-Infektion in der Regel asymptomatisch. Wie am Beispiel der murinen CMV (mCMV)-Infektion gezeigt werden konnte, erfolgt die Immunkontrolle durch CD8 T-Zellen. Im Infektionsmodell der BALB/c (H-2d) Maus dominieren CD8 T-Zellen mit Spezifität für zwei antigene Peptide: Ein Ld-restringiertes Peptid aus dem immediate early (IE1)-Protein m123, sowie ein Dd-restringiertes Peptid aus dem early (E)-Protein m164. Der konzertierten Aktion der viralen Immunevasionsproteine von mCMV gelingt es nicht, die Expression dieser beiden Peptide auf der Oberfläche infizierter Zellen zu verhindern. Der ORFm164 wurde 1996 von Rawlinson et al. vorhergesagt und umfasst demnach 1284 Nukleotide, die für ein Protein von 46,6 kDa kodieren. Über die mRNA und das tatsächliche Genprodukt des ORFm164 war zu Beginn dieser Arbeit jedoch nichts bekannt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptions- und Translations-Analysen zeigten, dass der eigentliche ORFm164 kürzer ist als vorhergesagt. So konnte mittels 5´/3´ RACE eine ungespleißte, 2004 Nukleotide große mRNA identifiziert werden, die einen 1011 Nukleotide langen ORF, sowie 5´ und 3´ flankierende UTRs umfasst. Das eigentliche Start-AUG der m164-mRNA liegt in einer Kozak-ähnlichen Konsensussequenz, wobei dieses Startcodon nicht dem von Rawlinson vorhergesagten ersten AUG entspricht. Vielmehr startet die Translation am dritten AUG und generiert ein m164 Genprodukt mit einer apparenten molekularen Masse von 38 kDa. Schließlich konnte m164 als Typ-I Membranglykoprotein charakterisiert werden. Das Protein ist ein frühes E-Phase Protein, das bereits ab 2 h p.i. und während der gesamten E-Phase abundant exprimiert wird. Pulse-Chase Experimente wiesen darauf hin, dass m164 relativ instabil ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz konnte neben einer ER-Lokalisation auch eine Kolokalisation von m164/gp38 mit den Proteinen der inneren Kernmembran Emerin und LaminB2 nachgewiesen werden. Eine direkte Interaktion zwischen diesen Proteinen und m164/gp38 konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)-Experimente allerdings ausgeschlossen werden. FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching)-Analysen haben ergeben, dass m164/gp38 in der äußeren Kernmembran lokalisiert ist. Somit könnte m164/gp38 eine Rolle beim Prozess des Deenvelopments der im Perinuklearraum lokalisierten primären Virionen spielen, indem es die Fusion zwischen primärer Virushülle und äußerer Kernmembran unterstützt und dadurch die Freisetzung der Kapside ins Zytoplasma ermöglicht. Diese Hypothese soll in weiterführenden Arbeiten überprüft werden.
• Human Cytomegalovirus (hCMV) is a ubiquitous pathogen. In immunocompetent individuals CMV infection is usually asymptomatic, although it often causes life-threatening complications in immunosuppressed organ and bone marrow transplant recipients. In the case of murine CMV (mCMV) immune control in immunocompetent individuals is mediated primarily by CD8 T cells. In the infection model of the BALB/c (H-2d) mouse, CD8 T cells with specificities for two antigenic peptides dominate, namely those with specificity for an Ldrestricted peptide derived from the immediate early protein m123 (IE1) and those with specificity for a Dd-restricted peptide from the early protein m164. Despite the concerted action of all viral immune evasion proteins, both peptides are presented at the cell surface of infected cells, thereby enabling the host immune system to control the infection. Originally, Rawlinson et al. (1996) predicted ORFm164 to be 1284 nucleotides in length, encoding a protein with a molecular mass of 46.6 kDa. At the beginning of the present study, nothing was known about the ORFm164 RNA transcript or gene product. The transcription and translation assays performed here show that ORFm164 is actually shorter than first thought. Using 5´/3´ RACE it was possible to identify an unspliced 2004 nucleotide mRNA, which contained the ORF (1011bp) as well as flanking 5´ and 3´ untranslated regions (UTR). The start codon was found to be incorporated into a Kozak consensus sequence, different from the one predicted by Rawlinson et al. (1996). In fact, translation was initiated at the third AUG downstream from that previously predicted, with the resultant m164 protein having an apparent molecular mass of 38 kDa. This study demonstrates that m164 is a type I membrane glycoprotein containing one transmembrane domain. It is an early E-phase protein, being abundantly expressed during the entire E-phase starting 2 h post infection. Pulse-chase experiments revealed a relative instability of the m164 protein. Using indirect immunofluorescence it was possible to detect not only the ER localization of the m164 protein but also a colocalization with two proteins of the inner nuclear membrane - Emerin and LaminB2. However, a direct interaction between these proteins and m164 was excluded by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) experiments. Subsequent Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) assays showed that m164 localizes to the outer nuclear membrane. Because of its localization to the outer nuclear membrane, it is tempting to speculate that m164 plays a role during the de-envelopment process of primary virions. Theoretically, it could facilitate the fusion between primary virions and the outer nuclear membrane that leads to a transition of capsids into the cytoplasm. This hypothesis will be addressed in continuing studies.