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Kapil Bharti

• In contrast to the class A heat stress transcription factors (Hsfs) of plants, a considerable number of Hsfs assigned to classes B and C have no evident function as transcription activators on their own. In the course of my PhD work I showed that tomato HsfB1, a heat stress induced member of class B Hsf family, is a novel type of transcriptional coactivator in plants. Together with class A Hsfs, e.g. tomato HsfA1, it plays an important role in efficient transcrition initiation during heat stress by forming a type of enhanceosome on fragments of Hsp promoter. Characterization of promoter architecture of hsp promoters led to the identification of novel, complex heat stress element (HSE) clusters, which are required for optimal synergistic interactions of HsfA1 and HsfB1. In addition, HsfB1 showed synergistic activation of the expression of a subset of viral and house keeping promoters. CaMV35S promoter, the most widely expressed constitutive promoter turned out to be the the most interesting candidate to study this effect in detail. Because, for most house-keeping promoters tested during this study, the activators responsible for constitutive expression are not known, but in case of CaMV35S promoter they are quite well known (the bZip proteins, TGA1/2). These proteins belong to the acidic activators, similar to class A Hsfs. Actually, on heat stress inducible promoters HsfA1 or other class A Hsfs are the synergistic partners of HsfB1, whereas on house-keeping or viral promoters, HsfB1 shows synergistic transcriptional activation in cooperation with the promoter specific acidic activators, e.g. with TGA proteins on 35S promoter. In agreement with this the binding sites for HsfB1 were identified in both house-keeping and 35S promoter. It has been suggested during this study that HsfB1 acts in the maintenance of transcription of a sub-set of house-keeping and viral genes during heat stress. The coactivator function of HsfB1 depends on a single lysine residue in the GRGK motif in its CTD. Since, this motif is highly conserved among histones as the acetylation motif, especially in histones H2A and H4,. It was suggested that the GRGK motif acts as a recruitment motif, and together with the other acidic activator is responsible for corecruitment of a histone acetyl transferase (HAT). So, the effect of mammalian CBP (a well known HAT) and its plant orthologs (HAC1) was tested on the stimulation of synergistic reporter gene activation obtained with HsfA1 and HsfB1. Both in plant and mammalian cells, CBP/HAC1 further stimulated the HsfA1/B1 synergistic effect. Corecruitment of HAC1 was proven by in vitro pull down assays, where the NTD of HAC1 interacted specifically both with HsfA1 and HsfB1. Formation of a ternary complex between HsfA1, HsfB1 and CBP/HAC1 was shown via coimmunoprecipitation and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). In conclusion, the work presented in my thesis presents a new model for transcriptional regulation during an ongoing heat stress.
• Im Gegensatz zu den pflanzlichen Hitzestreßtranskriptionsfaktoren (Hsf) der Klasse A zeigen die Vetreter der Klassen B und C keine offensichtliche Funktion als Transaktivatoren in den geläufigen Testsystemen. Im Verlauf der experimentellen Arbeiten zu dieser Promotion ist es aber gelungen, die komplexe Rolle eines wichtigen Vetreters der Klasse B der Tomate (Hsf B1) aufzuklären. Im Zusammen-spiel mit Klasse A Hsfs, z.B. HsfA1, spielt er eine unverzichtbare Rolle für die effizienten Veränderungen der Transkriptionsprogramme im Verlauf der Hitzestreß-antwort. Auf der einen Seite wirkt er als Teil von Hitzestress-Enhanceosomen als synergistischer Verstärker für die Hitzestress-induzierte Genaktivierung durch HsfA1. In umfangreichen Studien zur Promoterarchitektur habe ich die Voraussetzungen für die Assemblierung solcher Enhanceosomen aufgedeckt. Auf der anderen Seite wirkt HsfB1 als Coaktivator auch an der Aufrechterhaltung bzw. Wiederherstellung der Transkription wichtiger Haushaltsgene während und nach der Stressperiode mit. Von exemplarischen Interesse ist in diesem Zusammenhang die starke Stimulation der Transkription von Konstrukten mit dem Blumenkohlmosaik-virus 35S Promoter, der als starker konstitutiver Promoter für viele pflanzliche Expressionsplasmide genutzt wird. Während für die meisten der von uns getesteten Haushaltsgene die für die konstitutive Expression verantwortlichen Aktivatorproteine nicht bekannt sind, sind die Aktivatoren für den 35S Promoter gut untersucht (bZip Proteine TGA1/2). Sie gehören wie die Klasse A Hsfs zu den sogenannten sauren Aktivatorproteinen, d.h. die fördernde Wirkung von HsfB1 auf die Transcription von Haushalts- und viralen Genen sowie von Hitzestressgenen beruht auf der universellen Fähigkeit, in Kombination mit sauren Aktivatoren die Rekrutierung von Komponenten des Initiationskomplexes für die Transkription zu verstärken. Entsprechende Bindungsstellen für HsfB1 haben wir in allen von uns getesteten Haushaltsgenen und auch im 35S Promoter identifiziert. Die eingehende Charakterisierung von HsfB1 Mutanten haben gezeigt, dass die Rolle als Coaktivator essentiell mit einem einzigen Lysinrest in der C-terminalen Domäne verbunden ist, der Teil eines Histon-artigen -GRGK- Motifs ist. Da solche Motive die hauptsächlichen Erkennungsstellen für Acetyltransferasen in den N-terminalen Domänen der Histone H2A und H4 darstellen, haben wir die Rolle der in Tieren und Pflanzen konservierten Histonacetyl-Transferase CBP bzw. des orthologen Proteins HAC1 aus Arabidopsis in unseren Testsystemen untersucht. In der Tat kann die synergistische Aktivierung der Transkription durch HsfA1 und HsfB1 in Gegenwart von HAC1/CBP in pflanzlichen wie in tierischen Zellen noch gesteigert werden. Die unmittelbare Interaktion von HsfA1, HsfB1 und CBP/HAC1 in einem ternären Komplex wurde durch Coimmunpräzipitation, Pull-down Assays und in vitro DNA Bindungsstudien (EMSA, electrophoretic mobility shift assays) belegt. In Zusammenfassung meiner Untersuchungen habe ich ein neues Modell für die Regulation der Transkriptionsprozesse im Verlauf der Hitzestressantwort entwickelt.