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Katrin Feldbauer

• Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
• Channelrhodopsin-2, oder kurz ChR2, aus dem Augenfleck der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, ist ein lichtgesteuerter einwärts-gleichrichtender Ionenkanal, der monovalente Kationen leitet (Nagel et al., 2003). Das Maximum des Aktionsspektrums liegt bei ~460 nm. Der Photostrom von ChR2 ist auf die für die Familie der Rhodopsine typische 7-Transmembranregion beschränkt, was Messungen mit einem auf diesen Bereich verkürzten ChR2 möglich macht. Die typische Stromantwort der Kanäle unter patch clamp Bedingungen auf einen blauen Lichtstimulus besteht aus einem Peak und einer stationären Phase, die erst durch Abschalten des Lichtes beendet wird. Seit der ersten Beschreibung im Jahr 2003 durch Nagel et al. findet ChR2 eine breite Anwendung im Gebiet der Neurobiologie, da es eine lichtgesteuerte Depolarisierung von Neuronen in Kultur und im lebenden Organismus ermöglicht (z.B. Boyden et al., 2005; Li et al., 2005). So wurde ChR2 bereits in Mäusen und Ratten (z.B. Bi et al., 2006), Drosophila melanagaster (z.B. Schroll et al., 2006), Caenorhabditis elegans (z.B. Nagel et al., 2005b), Embryonen des Huhns (Li et al., 2005), und Zebrafischen (Douglass et al., 2008) exprimiert. Dennoch waren lange Zeit wichtige Eigenschaften des Kanals unbekannt. Mit der Beschreibung des Photozyklus (Bamann et al., 2008; Ritter et al., 2008) sowie Mutationen von Aminosäureresten, die in Bakteriorhodopsin eine essentielle Funktion haben (z.B. Nagel et al., 2005b), wurden wichtige Schritte zum Verständnis des Kanals gemacht. Jedoch ist bis heute die Einzelkanalleitfähigkeit nicht detailliert charakterisiert worden. Verschieden Schätzungen ergaben Werte von 50 fS (140 mM NaCl in der Badlösung; Nagel et al., 2003) und etwa 0,3 pS (6 mM K+ und 100 μM Ca2+; Harz et al., 1992). Zudem wurde kürzlich ein Wert von 1,1 pS publiziert (mit Einzelwerten im Bereich von 0,25 bis 2,42 pS (n=8); Lin et al., 2009). Dieser Wert wurde aus dem Bereich der Stromantwort des Kanals erworben in dem der Peakstrom in den stationären Bereich übergeht. Dieser Übergangs ist von der Lichtintensität und den Ausgangskonzentrationen des Licht- und Dunkelheits-adaptiereten Channelrhodopsin-2 abhängig und bisher kinetisch noch nicht ausreichend charakterisiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Einzelkanalleitfähigkeit von Channelrhodopsin-2 mit Hilfe der stationären Rauschanalyse (z.B. DeFelice, 1981) untersucht: Das Öffnen und Schließen einer Population identischer Kanäle verbirgt sich in dem Rauschen um den mittleren Strom einer stationären Messung einer Zelle, die diese exprimiert. Dieses Kanalrauschen kann durch die Zerlegung dieses stationären Stromes in seine Frequenzanteile durch eine Fouriertransformation sichtbar gemacht werden. HEK293 Zellen, die Channelrhodopsin-2, bzw. ein ChR2 mit der Punktmutante H134R stabil exprimierten, wurden in der Ganzzellableitung der Patch Clamp Technik unter gekülten Bedingungen (11.5°C) vermessen. Zunächst wurde mit Hilfe von Spannungssprungprotollen das Umkehrpotential bei sättigenden Lichtverhältnissen bestimmt (473 nm), gefolgt von der Bestimmung des Punktes an dem die Amplitude der stationären Photoströme im Vergleich zu sättigenden Bedingungen halbiert war (jeweils bei -60 mV). Unter diesen halbmaximalen Lichtbedingungen wurden nun erneut das Umkehrpotential, sowie die Kanalschließzeit τoff bestimmt. Stationäre Aufnahmen (2 Minuten) abwechselnd ohne (3 Aufnahmen) und mit Beleuchtung (2 Aufnahmen) wurden in Folge aufgenommen, anschließend jeweils Fouriertransformiert und ein Differenzspektrum gebildet (die gemittelten Spektren mit Beleuchtung wurden von den gemittelten Spektren ohne Beleuchtung subtrahiert). .....