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Ulrich Terpitz

• Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
• Ion channels provide therapeutical points of attack for many diseases. That is why they play a prominent role in pharmacological and medical research. The need of further research is enormous and, consequently, also the requirement of systems which allow the analysis of ion channels and / or a variety of drugs in highthroughput scale. Most current high-throughput systems are based on a modified patch clamp technique, but compared to manual patch clamp systems they still have some drawbacks. Therefore, in the present work within the framework of a “BioChancePlus” project (supported by the German Federal Ministry for Education and Research) an alternative method, the Fakir-method, was developed. Its application in high throughput systems was evaluated. The Fakir method consists of the following principles: A cell is exposed to an inhomogeneous, electrical alternating field. It experiences a dielectrophoretic force and is accelerated in the direction of metal nano electrodes. Due to its kinetic energy the cell is penetrated and thereby electrically contacted by the electrodes. Thus, a subsequent, intracellular measurement under physiological conditions is possible. Compared to the patch clamp method the fakir method offers the advantage of cell cytoplasm preservation and the requirement of only a low cell suspension density. On the other hand, however, the electrode is quickly polarized and the intracellular composition of the cell is not precisely determined. To proof the Fakir-method in experiments a microfluidic chamber with disposable metal micro- and also nanoelectrode chips was designed. It allowed the microscopic observation of the contacting process. The characterization of the electrodes was performed by potential measurements as well as by means of impedance spectroscopy. For the exact dielectrophoretic attraction of cells an amplitude modulator was developed. Cells could be contacted either individually or in groups. Intracellular potential measurements of HEK293 cells, expressing the blue light gated cation channel Channelrhodopsin-2 (ChR2), showed that membrane proteinmediated voltage changes can be measured by using the Fakir-method. Malfunctions of the Fakir-model system were analyzed. The results were then used to create a concept for a highly reproducable production of nanoelectrode arrays taking advantage of the 2PP-technology. Particularly large cells are useful as biosensors. An effective enlargement of cells can be reached by multi-cell electrofusion. This kind of giant cell production is very promising because of the possibility to integrate the electrofusion process into an automated microfluidic system. Apart from HEK293 cells it was possible to develop appropriate protocols for the production of protoplasts from both, S. cerevisiae and P. pastoris yeasts, and to produce giant cells by multi cell electrofusion. In the context of this work these giant cells were biophysically characterized. Capacity measurements, the expression of YFP in the membranes and the use of sodium fluorescein within the patch pipette solution demonstrated that the giant cells indeed are single compartments. Thus, the entire membrane surface is accessible for electrophysiological experiments. Comparative patch clamp measurements were performed on both, parental and electrofused, ChR2-expressing cells. The overexpressed protein was still functional after electrofusion and also the expression density remained unchanged. Hence, electrofused giant cells - far beyond use in high throughput systems - also provide an interesting tool, e.g. for the study of electrogenic membrane proteins with low current amplitude or for electrophysiological measurements on HEK293 cells in the giant-inside-out configuration. Lipophilic anions can be used to vary the electrical parameters as well as to enhance the cell stability during electromanipulation processes. Therefore, the voltage dependency of the specific membrane capacity increase was analyzed in patch clamp experiments using HEK293 cells in presence of lipophilic anions.