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Karolina Zwißler

• Eine Autoimmunreaktion impliziert Verlust der Autotoleranz und ermöglicht Immunreaktionen gegen körpereigene Antigene. Bei autoimmuner Erkrankung der Schilddrüse Typ M. Basedow führt die Aktivierung von T-Lymphozyten zur vorübergehenden und sequentiellen Expression von spezifischen Molekülen auf der Zelloberfläche, z.B. CD25 oder HLA-DR. Dass die CD4+CD25+-, CD8+CD25+-Zellen sowie HLA-DR-positive T-Zellen eine wesentliche Rolle in der Autoimmunität der Schilddrüse haben, ist erwiesen. Dennoch sind die genauen pathophysiologischen Mechanismen ungeklärt. Zusätzlich haben mehrere Studien eine Erhöhung der B-Zellen, insbesondere die Erhöhung der Anzahl von CD19+CD25+-Zellen bei Ophtalmopathie, sowie eine Erhöhung der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen beschrieben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe der Durchflusszytometrie die Veränderungen in der Expression von Aktivierungsmarkern CD25, HLA-DR und CD94 auf peripheren und intrathyreoidalen Lymphozytensubpopulationen bei M. Basedow und Struma zu bestimmen. Im ersten Teil der Arbeit wurden periphere Lymphozytensubpopulationen von M. Basedow, Struma, und Kontrollgruppe untereinander verglichen. Die Analyse von peripheren T-Helferzellen CD3+CD4+CD25- zeigte sowohl bei M. Basedow- als auch bei Struma-Patienten eine signifikant niedrigere Anzahl im Vergleich zur Kontrolle, während die peripheren CD3+CD4+CD25+-Zellen signifikant höhere Werte gegenüber der Kontrollgruppe aufwiesen. Im Rahmen der Untersuchung traten die peripheren aktivierten B-Zellen (CD45+CD19+CD25+) sowie peripheren NK-Zellen (CD45+CD56+CD94-, CD45+CD56+CD94+, CD45+CD8-CD56+, CD45+CD3-CD56+ und NK-T-Zellen (CD45+CD8+CD56+, CD45+CD3+CD56+) bei Struma in eine signifikant erhöhten Anzahl im Vergleich zur Kontrolle auf. Die nicht aktivierten B-Zellen (CD45+CD19+CD25-) zeigten bei Patienten mit M. Basedow eine signifikante Erhöhung der Anzahl verglichen mit der Strumagruppe. Diese Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede in den Aktivierungsmustern von M. Basedow und Struma gegenüber der Kontrolle. Somit kann man bei beiden Erkrankungen über eine immunologische Reaktion in der Peripherie sprechen, die sich deutlich von der bei gesunden unterscheidet. Dennoch war in der Peripherie bei M. Basedow-Patienten die Aktivierung von B-Zellen, wahrscheinlich autoimmun bedingt, beeinträchtigt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intrathyreoidale Lymphozytensubpopulationen von M. Basedow- und Struma-Patienten untereinander verglichen. Die Anzahl der intrathyreoidalen CD3+CD4+CD25--Zellen von M. Basedow war signifikant höher im Vergleich zu Struma, andererseits waren die Werte der CD45+CD19+CD25+-Zellen signifikant niedriger. Zusätzlich wurde bei M. Basedow-Patienten eine Analyse der Verhältnisse zwischen aktivierten und nicht aktivierten intrathyreoidalen Lymphozytensubpopulationen durchgeführt. Der Anteil nicht aktivierter T-Helferzellen (CD4+CD25-), zytotoxischer Zellen (CD8+CD25-) und B-Zellen (CD19+CD25-) war höher als der Anteil aktivierter T-Helferzellen (CD4+CD25+), zytotoxischen Zellen (CD8+CD25+) und B-Zellen (CD19+CD25+). Die hier vorgestellten Ergebnisse legen nahe, dass die Fähigkeit der CD4+CD25+-Zellen, die Proliferation von CD4+CD25--Zellen zu unterdrücken, bei M. Basedow-Patienten beeinträchtig ist. Dies führt bei diesen Patienten zu einer Zunahme der CD4+CD25--Subpopulation. Die Änderung der Verhältnisse von intrathyreoidalen aktivierten zu nicht aktivierten T-Helferzellen scheint hierbei mit der Entwicklung von M. Basedow assoziiert zu sein. Im dritten Teil der Arbeit wurden periphere und intrathyreoidale Lymphozyten von M. Basedow gegenübergestellt. Die Anzahl von intrathyreoidalen aktivierten zytotoxischen Zellen von M. Basedow mit dem Phänotyp CD3+CD8+CD25+ war erhöht im Vergleich zur Peripherie. Derselbe Vergleich wurde auch bei Struma durchgeführt. Dabei zeigten die intrathyreoidalen CD3+CD4+HLA-DR+- CD3+CD4+CD25+- CD3+CD8+CD25+- und CD3+CD8+HLA-DR+-Zellen sowie CD45+CD56+CD94--NK-Zellen höhere Werte als Periphere. Somit konnten wir zeigen, dass bei M. Basedow die Aktivierung von CD3+CD4+HLA-DR+- CD3+CD4+CD25+- und CD3+CD8+HLA-DR+-Zellen in der Schilddrüse unterdrückt ist. Dies könnte als Unterscheidungsmerkmal zwischen M. Basedow und Struma wichtig sein. Im vierten Teil der Arbeit wurden die peripheren und intrathyreoidalen Lymphozyten nach der Kultivierung mit Thyreozyten verglichen. Die Kultivierung von peripheren CD3+CD4+HLA-DR--Zellen mit Thyreozyten von Patienten mit M. Basedow bzw. Struma zeigte eine Vermehrung dieser Zellen im Vergleich zur Kultivierung ohne Thyreozyten. Die Struma-Patienten zeigten jedoch bei Kultivierung mit Thyreozyten höhere Anzahlen von intrathyreoidalen aktivierten T-Helferzellen (CD3+CD4+HLA-DR+) und zytotoxischen Zellen (CD3+CD8+HLA-DR+), als kultiviert ohne Thyreozyten. Aufgrund der Ergebnisse in diesem Teil der Arbeit kann angenommen werden, dass ein hemmender Einfluss von Thyreozyten auf intrathyreoidalen CD3+CD4+HLA-DR+- und CD3+CD8+HLA-DR+ -Zellen bei M. Basedow vorhanden ist.
• The autoimmun reaction implicates a deficit of autotolerance and it permits the reaction against the autoantigens. The activation of T lymphocytes can lead to temporary expression of CD25 or HLA-DR on cell surface at autoimmune diseases such as graves disease. The Role of CD4+CD25+ and CD8+CD25+ cells at graves disease is already verfied, but exact pathophysiological mechanisms are unsolved. Several studies showed an increase of CD19+CD25+lymphocytes at thyroid ophtalmopathie and cytotoxic activity of NK cells. The aim of this study has been to analyse of changes at peripheral and intrathyreoidal lymphocyte subsets that have been activated by CD25, HLA-DR and CD94 antigens using flow cytometry at graves disease and goither. In part one of the study peripheral lymphozyte subsets have been compared at graves disease, goither and control group. The analysis of T-helper cells CD4+CD25- resulted in a significantly lower numbers at graves disease and goither patients compared to the control group. In contrast for CD4+CD25+ cells a significant increase in number was observed, as compared with the control group. Among peripheral activated B cells (CD45+CD19+CD25+), NK cells (CD45+CD56+CD94-, CD45+CD56+CD94+, CD45+CD8-CD56+, CD45+CD3-CD56+) and NK-T-cells (CD45+CD8+CD56+, CD45+CD3+CD56+) at goither an increase in number was noted compared to the control group. The number of non activated B cells CD45+CD19+CD25- of graves disease patients was significantly increased compared with goither patients. The results show a difference in the pattern of activation between graves disease and goither compared with the control group. In summary both graves disease and goither indicated an immunological reaction in peripheral blood which differed from the reaction in the control group. However the activation of B cells at graves disease was possibly driven by autoimmun processes. In part two of the study intrathyreoidal lymphocyte subsets at graves disease and goither patients have been compared. The number of intrathyreoidal CD3+CD4+CD25- cells from graves disease was significantly increased compared to goither, whereas the number of CD45+CD19+CD25+ cells was significantly lower. In addition, an analysis of the ratio between activated and non activated intrathyreoidal lymphocyte subsets at graves disease has been performed. The percentage of non activated T helper cells CD4+CD25- , cytotoxic cells CD8+CD25- and B cells CD19+CD25- was higher compared to the activated form of these cells (CD4+CD25+, CD8+CD25+ and CD19+CD25+). Based on these findings, it is likely that the ability of CD4+CD25+ cells to suppress the proliferation of CD4+CD25- cells was impaired at graves disease patients. This results in an increase of CD4+CD25- cells at graves disease. The change of ratio from activated to non activated intrathyreoidal T helper cells seems to be associated with the pathogenesis of graves disease. In part three of this study peripheral to intrathyreoidal lymphocyte subsets were compared. The number of intrathyreoidal activated cytotoxic cells from graves disease with phenotype CD3+CD8+CD25+ was increased compared to peripheral blood. The same comparison was made at goither patients. It showed that the number of intrathyreoidal CD3+CD4+HLA-DR+, CD3+CD4+CD25+, CD3+CD8+CD25+, CD3+CD8+HLA-DR+ cells and CD45+CD56+CD94-NK cells was higher compared with the peripheral blood. Hence it is shown that the activation of CD3+CD4+HLA-DR+ CD3+CD4+CD25+ und CD3+CD8+HLA-DR+cells in thyroid gland were inhibited. Such difference can be an important feature to differentiate between graves disease and goither. In part four of the study peripheral and intrathyreoidal lymphocyte subsets were analysed after cultivation with thyreocytes. The cultivation of peripheral CD3+CD4+HLA-DR-cells with thyreocyres from graves disease or goither showed an increased number of these cells compared with cultivation lacking thyreocytes. The goither patients showed higher numbers of intrathyreoidal activated T helper cells (CD3+CD4+HLA-DR+) and cytotoxic cells (CD3+CD8+HLA-DR+) cultivated with thyreocytes in contrast to that cultivated lacking thyreocytes. As a result of this part it can be assumed that there is an inhibitors influence of thyreocytes on intrathyreoidal CD3+CD4+HLA-DR+ and CD3+CD8+HLA-DR+cells in graves disease.