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Untersuchungen zu Veränderungen des Zytostatika-Resistenz-Phänotyps bei Philadelphia-Chromosom positiven Leukämien unter Imatinib-Therapie

  • Bei vielen malignen Erkrankungen sind deregulierte Signalübertragungswege bedeutsam für die Pathogenese. Modellcharakter hierfür haben die Philadelphia (Ph) Chromosom positiven Leukämien, zu denen 90 % der chronisch myeloischen Leukämien und etwa 15 - 30 % akuten lymphatischen Leukämien des Erwachsenen gehören. Das Philadelphia Chromosom, das durch die reziproke Translokation von Chromosom 9 und 22 entsteht, codiert für ein tumorspezifisches Fusionsprotein, die BCR-ABL Tyrosinkinase. Diese ist konstitutiv überaktiviert und führt zu autonomen Wachstum und maligner Entartung der Philadelphia positiven Zellen. Ein neuer therapeutischer Ansatz, die Hemmung des pathogenetisch bedeutsamen Signalweges, ist mit dem BCR-ABL spezifischen Tyrosinkinase Inhibitor Imatinib möglich. Der starke antileukämische Effekt von Imatinib gegenüber BCR-ABL positiven Leukämien konnte in klinischen Studien mit Ansprechraten von etwa 60 % bei der Ph+ALL gezeigt werden. Dieser Erfolg wird jedoch von der Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib getrübt. So entwickelt die Mehrzahl der Patienten mit Ph+ALL nach einer medianen Behandlungszeit von 2 Monaten ein Rezidiv. Ein häufiger Resistenzmechanismus bei Polychemotherapien ist die erhöhte Expression der pleiotrope Zytostatikaresistenz vermittelnden Proteine P-gp und MRP-1. Diese Arbeit sollte untersuchen, ob die ABC-Transportproteine P-gp und MRP-1 bei der Imatinibresistenz beteiligt sind. MRP-1 und das durch das MDR-1 Gen codierte P-gp sind membranständige Transportproteine, die Tumorzellen durch Auswärtstransport von vielen unterschiedlichen, chemisch nicht verwandten Zytostatika, Resistenzen gegenüber diesen Substanzen verleihen. Um die Rolle von P-gp und MRP-1 bei der Entwicklung der Imatinibresistenz zu bestimmen, wurde untersucht, ob Imatinib ein Substrat von P-gp oder MRP-1 ist, und ob es während der Behandlung mit Imatinib zu einem Anstieg der funktionellen Aktivität dieser Proteine kommt. Mittels transfizierter Zelllinien ließ sich zeigen, dass die P-gp Substrate Calcein AM und Tritium-markiertes Vinblastin in Anwesenheit von Imatinib schlechter transportiert werden. Bei Annahme eines kompetetiven Mechanismus lag die Vermutung nahe, dass Imatinib nicht nur ein Inhibitor des P-gp bedingten Transports von Calcein AM und Vinblastin ist, sondern selbst ein Substrat. Durch Verwendung einer P-gp transfizierten Zelllinie in einem Transwellassay, in dem diese einen vektoriellen Substrattransport bewirkt, konnte direkt gezeigt werden, dass Imatinib durch P-gp nicht aber durch MRP-1 und MRP-2 transportiert wird. Somit ist P-gp potentiell in der Lage, Resistenzen gegen Imatinib auszulösen. Um die funktionelle Aktivität von P-gp in den mononukleären Zellen der mit Imatinib behandelten Patienten bestimmen zu können, wurde eine durchflusszytometrische Methode unter Verwendung von Calcein AM etabliert. Die untersuchten Patientenzellen zeigten jedoch bei niedrigem Ausgangsniveau keinen Anstieg der funktionellen P-gp Aktivität nach Resistenzentwicklung, so dass weder MRP1 noch P-gp Anteil an der Resistenzentwicklung bei Ph+ALL gegenüber Imatinib zu haben scheinen. Die Möglichkeit, die konstitutiv aktive Tyrosinkinase von BCR-ABL mit Imatinib zu inhibieren, ermöglicht es, pathogenetische Charakteristika der BCR-ABL positiven Leukämien zu untersuchen. Die Ph+ALL ist charakterisiert durch ihre schlechte Prognose mit einem Langzeitüberleben von weniger als 10 % bei konventionellen chemotherapeutischen Regimes. Ob die Zytostatikaresistenz vermittelnden Proteine Pgp und MRP-1 hierfür ursächlich sind, sollte in einem weiteren Teil der Arbeit untersucht werden. Durch Hemmung der BCR-ABL spezifischen Tyrosinkinase von Philadelphia Chromosom positiven Zelllinien mit Imatinib kam es bei einem Teil dieser Zelllinien zur Abnahme des MRP-1 Proteinniveaus und der MRP-1 mRNA Expression. Dies begründete die Hypotheose, dass die aktivierte BCR-ABL Tyrosinkinase zu einer Hochregulation der MRP-1 Transkription führt, und damit für die schlechte Prognose ursächlich ist, lag nahe. Weder c-kit noch die BCR-ABL nachgeschalteten Signalproteine RAS-MAP-Kinase, c-MYC und STAT 5 waren bei der Herrunterregulation von MRP-1 unter Imatinib beteiligt. Durch den Nachweis der vorwiegend zytoplasmatischen Lokalisation von MRP-1 in den untersuchten Lymphoblasten mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie und durch den Nachweis einer sehr niedrigen funktionellen Aktivität von MRP-1 in diesen Zellen mittels Durchflusszytometrie eine Bedeutung von MRP-1 für die schlechte Prognose nicht anzunehmen.
  • Deregulation and activation of molecular pathways is crucially involved in the pathogenesis of malignant disease. In 90 % of CML and 15 % - 30 % of ALL the Philadelphia (Ph) chromosome is found and essential for initiating and maintaining the transformed phenotype. The Ph chromosome is characterized at the molecular level by a reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22, that leads to formation of a BCR-ABL fusion protein with enhanced and deregulated kinase activity. Recently, imatinib a competitive selective inhibitor of the abl tyrosine kinase has been shown in clinical trials to have pronounced anti-leukemic activity against BCR-ABL expressing leukemia's. In patients with relapsed or chemotherapy-refractory Ph+ALL hematologic response rates of 60-70% have been reported. These responses are generally brief, however, with resistance developing after a median of 2 months. The present study assessed if the ABC-transport proteins P-gp or MRP-1 are involved in imatinibresistance. MRP-1 and P-gp, which is encoded by the mdr-1 gene, are the most common reason for acquisition of resistance to a broad spectrum of anticancer drugs. The over expression of these membrane proteins is considered to result in multidrug resistance by energy-dependent efflux of many anticancer drugs from cell. Therefore it was the aim of the study to assess whether imatinib is a substrate of P-gp and/or MRP- 1/2, and whether clinical resistance to imatinib is associated with high-level activity of these transporters in Ph+ALL. Most substrates of P-gp or MRP-1 are competitive inhibitors of other substrates of these ABC-transporters. Using MDR-1 transfected cell lines over expressing P-gp, imatinib showed an inhibitory effect on Calcein AM and vinblastine transport mediated by P-gp. Direct evidence that imatinib is a substrate of P-gp was obtained with a transwell assay in which MDR-1 and MRP-1 transfected cell lines cause a vectorial drug transport. In this assay P-gp but not MRP-1/2 is able to transport imatinib. Thus P-gp could potentially be involved in imatinib-resistance. To measure functional activity of P-gp and MRP-1 in ALL blasts a flow cytometric method using calcein AM was established. The functional multidrug resistance was low in mononuclear cells of Ph+ALL patients. Most patients did not show an increase of activity after relapse. Therefore these data do not support the thesis of a prominent role of P-gp in imatinib resistance of patients with Ph+ALL. Inhibiting the constitutive active BCR-ABL kinase with imatinib make it possible to uncover characteristics of Ph+ cell lines. Ph+ALL is characterized by an aggressive clinical course with long-term survival of only 0 - 10 % with current chemotherapy regimes. Whether ABC-transporter like P-gp or MRP-1 are involved is only poorly understood. Interestingly, cultivating Ph+ cell lines with imatinib containing media leads to decreased MRP-1 protein and MRP-1 mRNA level in some cell lines. This suggests that a constitutive active BCR-ABL leads to up regulation of MRP-1 and thereby to the poor prognosis. C-kit and signaling pathways downstream BCR-ABL like RAS-MAPK, c- MYC and STAT 5 were not involved in the imatinib induced downregulation of MRP-1. But the low functional activity of MRP-1 shown by flow cytometry and the cytoplasmatic localization of MRP-1 demonstrated by confocal immunfluorescence microscopy in the assessed cell lines enfeeble the thesis of an involvement of MRP-1 in resistance of Ph+ALL to chemotherapy.

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Metadaten
Author:Matthias Hansen
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000004064
Referee:Dieter HoelzerGND, Gerd GeisslingerORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2003
Year of first Publication:2003
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/01/26
Release Date:2004/05/11
Page Number:116
HeBIS-PPN:121009890
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht