Open Access

Christina-Maria Hecker

• Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.
• Mit Hilfe von posttranslationalen Modifikation wie Phosphorylierung, Glykosylierung oder Acetylierung werden Eigenschaften von Proteinen moduliert, um sie u.a. zu aktivieren, zu hemmen oder in der Membran zu verankern. Eine besondere Art der posttranslationalen Modifikationen ist die Ubiquitinierung, bei der nicht nur ein kleines Molekül, sondern ein ganzes Protein an ein Substrat angeheftet wird. Ubiquitin ist ein kleines, ubiquitär exprimiertes Protein, welches kovalent an Lysinreste von Substraten gebunden werden kann. Dieser Prozess wird von drei verschiedenen Enzymen (E1-3) katalysiert. Das Ubiquitin-Aktivierungsenzym (E1) aktiviert Ubiquitin unter Verbrauch von ATP, das Ubiquitin- Konjugationsenzym (E2) bindet kovalent an Ubiquitin und die Ubiquitinligase (E3) vermittelt den Transfer zum Substrat. Ähnlich wie andere posttranslationale Modifikationen kann auch die Ubiquitinierung durch zelluläre Signale stimuliert werden. Spezifische Proteasen können Ubiquitin vom Substrat wieder abspalten. Die Ubiquitinierung ist somit ein induzierbarer und reversibler Prozess. Es gibt verschiedene Formen der Ubiquitin-Konjugation. In der einfachsten wird ein einzelnes Ubiquitinprotein an ein Substrat geheftet. Es ist jedoch auch möglich mehrere Ubiquitine an ein Substrat zu binden, falls am Substrat mehrere Lysinreste frei zugänglich sind. Außerdem hat Ubiquitin selbst mehrere freie Lysinreste, wodurch die Bildung von Ubiquitinketten möglich ist. Die wohl bekannteste Rolle der Ubiquitinierung ist die Markierung von Proteinen für den proteasomalen Abbau. Substrate, die mit Ubiquitinketten, die über die Aminosäure Lysin 48 von Ubiquitin gebunden sind, markiert wurden, werden im 26S Proteasom abgebaut. Die verschiedenen Formen der Ubiquitinierung spielen auch in vielen anderen Bereichen eine bedeutende Rolle. Hier ist die Endozytose von membranständigen Rezeptoren, die Reparatur der DNA und die Kontrolle verschiedener Signalwege zu erwähnen. Neben Ubiquitin wurden in den letzten Jahren einige Ubiquitin-ähnliche Proteine wie SUMO, NEDD8, ISG15 oder FAT10 entdeckt. Ihre dreidimensionale Struktur ähnelt der von Ubiquitin und sie werden ebenfalls mit Hilfe von E1, E2 und E3 Enzymen kovalent an Lysinreste von Substraten gebunden. Diese Modifikationen haben jedoch andere zelluläre Funktionen als die Ubiquitinierung. SUMO ist das zur Zeit am besten charakterisierte Ubiquitin-ähnliche Protein. Die Modifikation mit SUMO (Sumoylierung) findet hauptsächlich im Zellkern statt, wo unter anderem Transkriptionsfaktoren oder Histondeacetylasen sumoyliert werden. Auch beim Transport von Proteinen zwischen Zytosol und Zellkern durch die Kernpore spielt die Sumoylierung eine wichtige Rolle. Mittlerweile sind drei verschiedene SUMO Paraloge (SUMO1-3) charakterisiert worden. Die Sequenz von SUMO1 ist zu ca. 48% mit der von SUMO2 identisch, während SUMO2 und SUMO3 fast vollständig identisch (98%) sind. Über Unterschiede der Funktionen von SUMO1, SUMO2 und SUMO3 ist bis jetzt jedoch wenig bekannt. Modifikationen mit Ubiquitin und SUMO haben völlig unterschiedliche Konsequenzen in der Zelle. Sie können sich ergänzen, gegenseitig inhibieren oder völlig unabhängig voneinander agieren. Folglich müssen an ein sumoyliertes Protein andere Rezeptorproteine binden als an ein ubiquitiniertes Protein. Der Schüssel zum Verständnis dieser Prozesse sind spezifische SUMO und Ubiquitinbindungsdomänen, die in Rezeptorproteinen enthalten sind und die jeweilige Modifikation des Substrats erkennen. Andere Proteine können nun an das Rezeptorprotein binden, so dass ein funktioneller Komplex entsteht. Neun verschiedene Ubiquitinbindungsdomänen wurden bereits charakterisiert. Sie sind zwischen 20 und 150 Aminosäuren lang und formen unterschiedliche dreidimensionalen Strukturen. Fast alle binden mit relativ geringer Affinität (Kd ~100 μM) an einen hydrophoben Oberflächenbereich, der die Aminosäure Isoleucin 44 von Ubiquitin umgibt. In vitro binden sie meist stärker an Ubiquitinketten als an Monoubiquitin. Interessanterweise können auch die Rezeptoren, die eine Ubiquitinbindungsdomäne (UBD) enthalten oft selbst ubiquitiniert werden Die neusten Forschungsberichte deuten darauf hin, dass durch diese Ubiquitinierung des Ubiquitinrezeptors eine Konformationsänderung stattfindet, bei der die UBD an das angeheftete Ubiquitin bindet. Durch diese intramolekulare Bindung ist nun die UBD blockiert und steht nicht mehr zur Bindung von anderen ubiquitinierten Proteinen zur Verfügung. ...