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Tanja Babuke

• Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
• Einleitung: Die Reggie-Protein-Familie Die Reggie-Proteine wurden parallel und unabhängig voneinander durch zwei Gruppen vor ca. 10 Jahren entdeckt. Zum Einen fand die Arbeitsgruppe von Dr. Stürmer beide Proteine mit erhöhter Expression in sich regenerierenden optischen Neuronen im Goldfisch. In Anlehnung an „Regeneration“ wurden die Proteine Reggie-1 und Reggie-2 genannt (Schulte et al. 1997). Zum Anderen entdeckte die Gruppe um Dr. Lisanti beide Proteine bei der Analyse von Membran-Rafts. Weil sie in sogenannten Raft-Gradienten in dichteren Fraktionen schwebten (= to float), wurden sie Flotilline genannt (Bickel et al. 1997). Unglücklicherweise ist die Nummerierung der Proteine voneinander abweichend, Reggie-1 ist identisch mit Flotillin-2 und Reggie-2 mit Flotillin-1. Membran-Rafts sind besondere Mikrodomänen innerhalb von Membranen, die reich an Sphingolipiden, Cholesterol und speziellen Proteinen, wie z.B. GPI-verankerten Proteinen, sind. Durch die spezifische Anreicherung bestimmter Proteine können Signalabläufe selektiv beschleunigt werden (Simons and Ikonen 1997). Reggie-Proteine lokalisieren in Membran-Rafts und werden als Gerüstproteine (scaffolding proteins) innerhalb von Membranen betrachtet. Beide Reggie-Proteine bilden Homound Hetero-Oligomere, was wahrscheinlich ihre Funktion als „Gerüst“ unterstützt. Reggie-1 wird an Glycin 2 myristyliert und an den Cysteinen 4, 19 und 20 palmityliert. Für Reggie-2 wurde eine Membranbindung durch Palmitylierung des Cysteins 34 und durch zwei hydrophobe Regionen im N-Terminus gezeigt. Funktionell werden Reggies mit einer Vielzahl unterschiedlicher Signalwege in Verbindung gebracht. Sie spielen z.B. bei der T-Zell-Aktivierung eine Rolle, und besonders Reggie-2 wird eine Funktion im Insulinsignalweg zugeschrieben. Für Reggie-2 wurde auch eine Rolle in der Raftvermittelten Endozytose beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 in der Dynamin-, Clathrin- und Caveolin-unabhängigen Endozytose eine Rolle spielt (Glebov et al. 2006). Für Reggie-1 wurde beschrieben, dass es nach EGF-Stimulation von der Plasmamembran zu intrazellulären Vesikeln transloziert. Weiterhin wird Reggie-1 nach EGF-Rezeptor Aktivierung von Src phosphoryliert, und die Mutation des Tyrosins 163 blockiert die Translokation zu Endosomen (Neumann-Giesen et al. 2007). Dieselbe Studie zeigte auch, dass die Überexpression von Reggie-1 in beschleunigter Zellausbreitung resultiert und dass dieser Effekt von verschiedenen Tyrosinen innerhalb von Reggie-1 abhängig ist. Interessanterweise verursacht die lösliche Myristylierungsmutante (G2A) eine Verlangsamung der Zelladhäsion und wirkt damit dominant-negativ. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Überexpression von Reggie-1 eine verstärkte Bildung von filopodien-ähnlichen Ausläufern hervorruft (Neumann-Giesen et al. 2004). Allerdings ist bisher wenig über eine mögliche Funktion von Reggie-2 in aktin-abhängigen Prozessen oder über das Zusammenspiel beider Reggie-Proteine in deren Endozytose bekannt. Des Weiteren ist unbekannt, ob die Oligomerisierung und die Funktionen der Proteine, z.B. bei der Endozytose, in Zusammenhang stehen. ... Fazit Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Hetero-Oligomerisierung der Reggie-Proteine ihre Funktion beeinflusst. Beide Proteine sind in verschiedener Hinsicht auf einander angewiesen. Ohne Reggie-1 kann Reggie-2 nicht stabil exprimiert werden und nicht vollständig mit der Membran assoziieren. Reggie-1 hingegen braucht Reggie-2, um in Endosomen lokalisieren zu können. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Tyrosin 163 von Reggie-1 für dessen Hetero-Oligomerisierung nötig ist. Möglicherweise stellt die Phosphorylierung dieses Tyrosins nach EGF-Stimulation einen Auslöser für die folgende Endozytose dar. Allerdings bleibt spekulativ, ob Cholesterol-Bindung über Tyrosin 163 ebenfalls eine Rolle spielt. Die Analyse von Reggie-depletierten Zellen zeigte, dass Reggie-Proteine Zellmigration und Zellausbreitung positiv beeinflussen. Allerdings lösen sie unterschiedliche Effekte bei der Regulation von Fokalkontakten aus. Damit konnte erstmals bewiesen werden, dass auch Reggie-2 bei der Reorganisation des Aktinzytoskeletts eine Rolle spielt und dass beide Proteine hierbei unterschiedliche Funktionen ausüben.