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Nina Eschenröder

• Fettsäuren erfühlen vielfältige Funktionen im Organismus. Sie sind Brennstoffmoleküle, intrazelluläre Signalmoleküle und sie stellen wichtige Bestandteile biologischer Membranen dar. Der Abbau von Fettsäuren findet im Mitochondrium statt. Da langkettige Fettsäuren nicht ohne weiteres die Mitochondrienmembran überwinden können, benötigen sie einen Transportmechanismus, das so genannte Carnitin-Palmitoyltransferase- System. Zu diesem System gehören die Carnitin-Palmitoyltransferase-(CPT)-I an der Aussenseite, und die CPT-II an der Innenseite der Mitochondrienmembran, welche beide maßgeblich am Transport der Acylgruppe der Fettsäuren in Form von Acyl-CoA in das Innere des Mitochondriums beteiligt sind. CPT-I ist bei diesem Transport der geschwindigkeitbestimmende Schritt und existiert in zwei Isoformen, eine vom hepatischen (CPT-Ialpha) und einem vom muskulären Typ (CPT-Iß). Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der CPT-Ialpha in kultivierten Mesangiumzellen der Rattenniere und primären Hepatocyten der Rattenleber unter Bedingungen, die an der Entstehung und Progression entzündlicher Prozesse in diesen Organen beteiligt sind: 1) Hypoxie, 2) Stickstoffmonoxid (NO), 3) extrazelluläre sekretorische Phospholipasen A2 (sPLA2). Die Wahl der o.g. Bedingungen wurde aus folgenden Gründe gewählt: Viele Entzündungsreaktionen zeichnen sich durch eine massive Produktion von NO und einer erhöhten Sekretion von sPLA2 sowie durch eine lokale Durchblutungsstörung des Gewebes aus, was zu einer Sauerstoff-Unterversorgung der Zellen führt. Die CPT-Ialpha ist zudem mit einem Schlüsselenzym der Ketogenese, der mitochondrialen Hydroxymethylglutaryl-CoA-Syntase (mHG-CoA-Syntase) gekoppelt. Daher wurde die Wirkung von Hypoxie und exogenen sPLA2s auch auf die mHG-CoA-Syntase Expression untersucht. Diese Arbeit ist in vier Teile gegliedert. 1.) Zunächst wurden optimale Bedingungen erarbeitet, die mit einem spezifischen Antiserum mittels Western-Blot-Analyse erfolgreich zur Detektion des CPT-Ialpha Proteins in den verwendeten Zellsystemen führten. Zudem wurde mit Hilfe des Proteinsynthese-Inhibitors Cycloheximid keine Abnahme der CPT-Ialpha Proteinmengen festgestellt. Unter unstimulierten Bedingungen scheint dieses Protein demnach einem langsamen ‚turn-over’ zu unterliegen. 2.) In einer früheren Arbeit in Mesangiumzellen wurde gezeigt, dass durch DETANO- und Interleukin 1ß (IL-1ß)-Stimulation freigesetztes NO einen stimulierenden Effekt auf die CPT-Ialpha-Protein und -mRNA Expression aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde nun der NO-stimulierende Effekt auf den CPT-Ialpha-Promotor untersucht, um die Regulation der Transkription dieses Enzyms zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass sowohl DETA-NO als auch IL-1ß eine signifikante Steigerung der Promotor-Aktivität des -4495/+19 CPT-Ialpha Promotorkonstrukts induzieren, die mit dem Anstieg der mRNA- und Proteinexpression korreliert. Bezogen auf frühere Untersuchungen in Ratten- Hepatocyten zur Beteiligung der cytosolische Guanylatcyclase (cGC) und cyclischem Guanosinmonophosphat (sGMP) an der CPT-Ialpha Aktivität, wurde nun auch in Mesangiumzellen die Rolle des NO/cGMP-Signal-Weges in der Regulation des CPT-Ialpha untersucht. Es zeigte sich, dass die NO-induzierte CPT-Ialpha Expression durch den sGC-Inhibitor ODQ gehemmt werden konnte. Zudem induzierte YC-1 (ein sGC–Aktivator) die CPT-Ialpha Proteinexpression. Daraus konnte gefolgert werden, dass in Mesangiumzellen das unter proinflammatorischen Bedingungen gebildete NO die Expression der CPT-Ialpha über die Aktivierung der cGMPvermittelten Signaltransduktion reguliert. 3.) Zur Untersuchung des Einflusses von Hypoxie auf die CPT-Ialpha und mHMG-CoA Synthase-Expression in Rattenmesangiumzellen und -hepatocyten wurden zwei verschiedene Hypoxie-Modelle gewählt: a) Stimulation der Zellen mit CoCl2 oder mit dem Fe2+-Chelator Desferrioxamin unter normoxischen Bedienungen oder b) Kultivierung der Zellen in einer luftdichten Kammer, die mit einer 3%igen oder 1%igen O2-Mischung begast wird. In Measangiumzellen wurde die CPT-Ialpha Protein- und mRNA- Expression durch CoCl2, Desferrioxamin und 3% O2- vermittelte Hypoxie verstärkt. In Gegensatz dazu erhöht CoCl2 in den Hepatocyten nur die CPT-Ialpha Proteinmenge, während die mRNA-Expression unbeeinflusst blieb. Dagegen wurde in den Hepatocyten die CPT-Ialpha mRNA-Expression durch Desferrioxamin verstärkt und durch 1% O2 Hypoxia gehemmt. Solche unterschiedliche Auswirkungen von zwei hypoxischen Modellsystemen auf die CPT-Ialpha Protein- und mRNA-Expression in Mesangiumzellen und Hepatocyten könnten durch zellspezifische Regulationsmechanismen erklärt werden. Weiterhin wurde in beiden Zellsystemen die mRNA-Expression der mHMG-CoA Synthase unter allen eingesetzten hypoxischen Bedingungen reduziert. Dies bedeutet, dass die Ketogenese O2-abhängig abläuft und unter Hypoxie herunter reguliert wird. 4.) Der letzte Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Regulation der CPTIalpha Expression durch exogene sPLA2s in Mesangiumzellen und Hepatozyten. Auf Grund früherer Arbeiten war bekant, dass bei entzündlichen Prozessen sPLA2s in großen Mengen in Extrazellularräume und Körperflüssigkeiten sezerniert werden, um dort ein breites Spektrum von Fettsäuren aus Phospholipiden freizusetzen. Die Arbeitshypothese war, dass die auf diesem Weg freigesetzten Fettsäuren eine Hochregulation der CPT-Ialpha induzieren könnten. Es konnte gezeigt werden, dass es in Mesangiumzellen, die mit rekombinanten oder gereinigten sPLA2s exogen behandelt wurden, zu einer Erhöhung der CPT-Ialpha Expression auf Protein-, mRNAund Promotor-Ebene kommt. In Hepatocyten konnte ebenfalls eine verstärkte CPTIalpha-Proteinexpression festgestellt werden. Ein synergistischer Effekt mit TNF-alpha konnte nur auf Protein- und mRNA-Ebene, nicht jedoch auf Promotorebene beobachtet werden, was auf einen gemeinsamen Mechanismus der Promotor-Aktivierung durch sPLA2s und TNF-alpha schließen lässt. Wurden die Zellen gleichzeitig mit den Mitogen-aktivierten-Protein-Kinase (MAPK)-Inhibitoren PD 98059 and U0126 behandelt, wurde diese Hochregulation der CPT-Ialpha gehemmt. Daraus kann gefolgert werden, dass der sPLA2-induzierte Effekt auf die CPT-Ialpha -Expression durch die bereits bekannte sPLA2-induzierte Aktivierung der MAPK vermittelt wird. In Mesangiumzellen wurde weiterhin gezeigt, dass sPLA2s in Koinkubation mit TNF-alpha die mRNA Expression der mHMG-CoA Synthase stark induziert . In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass unter den gewählten proinflammatorischen Bedingungen die CPT-Ialpha sowohl auf der Ebene der Genexpression als auch auf Proteinebene reguliert wird. Auch die an die CPT-Ialpha gekoppelte mHMG-CoA Synthase wird in ihrer mRNA-Expression moduliert, sodass Effekte auf die Ketogenese zu vermuten sind. Zukünftige Arbeiten könnten zeigen, ob CPT-Ialpha als ein mögliches Target für die Entwicklung neuer Therapie- Strategien zur Verbesserung der Energiebilanz und damit auch der Überlebungsrate bei entzündlichen Erkrankungen dienen kann.
• Energy substrate utilisation rates are regulated during development and in response to physiological and pathophysiological stimuli. Injury and inflammation result in marked changes in whole body lipid metabolism, including free fatty acid oxidation (Show et al., 1989). The regulation of fatty acid oxidation is most dependent on the enzyme carnitine palmitoyl transferase-I (CPT-I), which exists in two isoforms, hepatic CPT-Ialpha and muscle CPT-Iß isoform, and which catalyses the initial reaction in the mitochondrial import of long-chain fatty acids. This is a tightly regulated step in the cellular fatty acid utilisation pathway to provide ATP. In concert with mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase (mHMG-CoA synthase), CPT-Ialpha is also responsible for the production of ketone bodies, the alternative fuel for extrahepatic organs. The aim of this thesis was to investigate the role of CPT-Ialpha under different inflammatory conditions, using pharmacologically active agents like nitric oxide donors, hypoxia-mimicking substances and exogenous phospholipases A2. This project is divided into four parts. The first part of the experimental work was devoted to the determination of the optimal Western blot conditions using a polyclonal antibody against CPT-Ialpha in rat mesangial and primary liver cells. The stability and concentration of CPT-Ialpha protein in these two cell cultures was also characterised. In a previous thesis performed by Dr. Annette Gans (2003), a stimulating effect of nitric oxide on the CPT-Ialpha protein and mRNA expression in rat mesangial cells was described. Thus, in the second part of the work, based on this thesis, studies were carried out to investigate the effect of NO on the CPT-Ialpha promoter activity. Moreover, a possible involvement of NO/cyclic GMP pathway on the regulation of CPT-Ialpha expression was explored. The data show that NO is able to increase luciferase activity of -4495/+19 CPT-Ialpha promoter construct in mesangial cells correlating with its activation at protein and mRNA level obtained in previous study. The NO-induced upregulation is reversed by the soluble guanylate cyclase sGC inhibitor, ODQ, at protein and mRNA level. Moreover, the sGC activator YC-1 was able to increase CPT-Ialpha protein level. These results suggest that in rat mesangial cells the cGMP pathway is possibly involved in the induction of CPT-Ialpha mRNA and protein expression through NO. The third part of this project includes the investigation of the effect of hypoxic conditions on CPT-Ialpha and mHMG-CoA synthase in rat mesangial and primary rat liver cells. Two models of hypoxic culture conditions were used in this study: 1) Exposure of the cells to the transition metal Co2+ or to the iron chelator desferrioxamine during normoxia. 2) Culturing cells in an air-tight chamber, which was infused by a gas mixture containing 3% or 1% O2. Hypoxia mimic Co2+ or desferrioxamine as well as 3% O2 hypoxia were able to upregulate CPT-Ialpha protein and mRNA expression in rat mesangial cells. In rat hepatocytes Co2+ induced CPT-Ialpha at protein level and did not cause changes at mRNA level, whereas the expose to more severe hypoxia (1% O2) markedly decreased and treatment with desferrioxamine increased CPT-Ialpha mRNA. Furthermore, Co2+ and desferrioxamine and 3% O2 hypoxia were also able to decrease mHMG-CoA synthase mRNA level in rat hepatocytes. These results suggest that in regulation of CPT-Ialpha and mHMG-CoA in rat mesangial cells and hepatocytes by the above mentioned models of hypoxic culture conditions different regulatory pathways are affected. The fourth part of the thesis was devoted to the effect of exogenously added secreted phospholipases A2 (sPLA2s) on CPT-Ialpha expression at the protein, mRNA and promoter level. This project was stimulated by a recent observation that sPLA2s, when released under inflammatory conditions into the extracellular space, cleave fatty acids from glycero-phospholipids, which then may trigger an upregulation of CPT-Ialpha expression. In addition, this part of the project includes preliminary studies on the molecular mechanisms of sPLA2s on mHMG-CoA synthase expression. The treatment with exogenously added sPLA2s and TNFalpha, which are known to amplify expression of endogenous sPLA2-IIA, led to induction of CPT-Ialpha at protein, mRNA and prompter level in mesangial cells and to protein level in hepatocytes. This effect was reduced by co-treatment of mesangial cells with mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitors PD 98059 and U0126, thus suggesting that sPLA2s-mediated induction of CPT-Ialpha might, at least partly, involve MAPK pathway. Moreover, the also mHMG-CoA synthase mRNA level was markedly enhanced by the costimulation of h-sPLA2-IIA with TNFalpha. In summary, this work demonstrated that the CPT-Ialpha is a carefully regulated protein that plays a critical role in response to inflammatory condition.