Open Access

Katrin Ackermann

• Rhythmic changes in environmental lighting conditions have ever been the most reliable environmental cue for life on earth. Nature has therefore selected a genetically encrypted endogenous clock very early in evolution, as it provided cells and subsequently organisms with the ability to anticipate persevering periods of light and darkness. Rhythm generation within the mammalian circadian system is achieved by clock genes and their protein products. The mammalian endogenous master clock, which synchronizes the body to environmental time, is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. As an integral part of the time-coding system, the pineal gland serves the need to tune the body to the temporal environment by the rhythmic nocturnal synthesis and immediate release of the hormone melatonin. In contrast to the transcriptional regulation of melatonin synthesis in rodents, a post-translational shaping is indicated in the human pineal gland. Another important mediator of circadian time and seasonality to the body is the pituitary gland. The aim of this work was to elucidate regulation of melatonin synthesis in the human pineal gland. Furthermore, presence and regulation of clock genes in the human pineal and pituitary gland, and in the SCN were analyzed. Therefore, human tissue, taken from regular autopsies, was analyzed simultaneously for different parameters involved in melatonin biosynthesis and circadian rhythm generation. Presented data demonstrate that post-mortem brain tissue can be used to detect the remnant profile of pre-mortem adaptive changes in neuronal activity. In particular, our results give strong experimental support for the idea that transcriptional mechanisms are not dominant for the generation of rhythmic melatonin synthesis in the human pineal gland. Together with data obtained for clock genes and their protein products in the pituitary, data presented here offer 1) a new working hypothesis for post-translational regulation of melatonin biosynthesis in the human pineal gland, and 2) a novel twist in the molecular competence of clock gene proteins, achieved by nucleo-cytoplasmic shuttling in neuronal and neuroendocrine human tissue. Furthermore, in this study, oscillations in abundance of clock gene proteins were demonstrated for the first time in the human SCN.
• Für alle auf der Erdoberfläche lebenden Organismen bedeutet der regelmäßige Wechsel zwischen Licht und Dunkelheit eine fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen und prägt damit ihre interne zeitliche Organisation. Durch die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus werden in Antizipation die tageszeitlichen Veränderungen der Umwelt abgebildet. Bei Säugern ist dieser zentrale endogene Oszillator der zirkadianen Rhythmogenese im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) des Hypothalamus lokalisiert. Über einen spezifischen neuronalen Schaltkreis, dem sogenannten photoneuroendokrinen System (PNS), erfolgt die Synchronisation des SCN mit der Umwelt und die Weitergabe der Zeitinformation an den Körper. Ein essenzieller Bestandteil des PNS ist neben der Retina, dem retino-hypothalamischen Trakt und dem SCN das Pinealorgan, in welchem die Melatoninproduktion die Länge der Dunkelphase in Abhängigkeit von Signalen des SCN kodiert. Das Schlüsselenzym der Melatoninsynthese ist die Arylalkylamin N-acetyltransferase (AANAT), deren Regulation artspezifisch ist und bei Nagern auf der transkriptionalen, bei allen bislang untersuchten Ungulaten und Primaten jedoch auf der post-translationalen Ebene erfolgt. Um das Enzym vor dem Abbau durch proteasomale Proteolyse zu schützen, wird es im Zytosol durch Komplexierung mit einem 14-3-3-Dimer gebunden. Die Generierung eines endogenen Rhythmus mit einer Periodenlänge von zirka 24 h erfolgt im SCN durch die sogenannten Uhrengene (Period, Cryptochrome, Clock, Bmal1). Diese konnten nicht nur im SCN selbst, sondern auch in allen bislang untersuchten peripheren Geweben und Organen nachgewiesen werden, darunter auch im Pinealorgan sowie der Hypophyse von Nagetieren. Dabei ist die Rolle der Uhrengene in peripheren Organen, welche keinen endogenen Oszillator besitzen und damit abhängig von Signalen des SCN sind, bislang nicht eindeutig geklärt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Mechanismen, die an der molekularen Synchronisation rhythmischer Vorgänge im humanen Pinealorgan, der Hypophyse und dem SCN beteiligt sind. Zur Beantwortung dieser Aufgabenstellung wurden humane Pinealorgane, Hypophysen und Hypothalami vom Zentrum der Rechtsmedizin aquiriert. Die Gewebe wurden in vier tageszeitliche Gruppen (Tag, Abend, Nacht, Morgen) entsprechend dem Todeszeitpunkt der Person eingeordnet. Mittels RT-PCR und real-time PCR, Enzymaktivitätsmessungen, ELISA, Immunoblotting und Immunofluoreszenz, sowie Co-Immunopräzipitation, wurden die humanen Gewebe simultan prozessiert. In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal die Komponenten der Melatoninbiosynthese auf RNA- und Proteinebene beim Menschen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine post-translationale Kontrolle der AANAT vorliegt. Dabei ist das AANAT Protein im Menschen unabhängig von der Tageszeit in konstanter Menge vorhanden, und liegt zur Verhinderung der proteasomalen Proteolyse im Komplex mit einem 14-3-3-Dimer vor. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch das letzte Enzym der Melatoninsynthese (HIOMT) Bestandteil dieses Komplexes ist, der überraschenderweise in zellularen Fortsätzen der Pinealozyten lokalisiert ist. Weiterhin konnten in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal Uhrengenproteine in humanem Nervengewebe nachgewiesen werden. Beim Menschen scheint, wie auch beim Schaf, keine transkriptionale Kontrolle der Uhrengene im Pinealorgan vorzuliegen. Stattdessen konnte hier eine Translokation ihrer Genprodukte in Abhängigkeit von der Tageszeit in humanen Pinealozyten und Hypophysenzellen gezeigt werden, das sogenannte ‚nucleo-cytoplasmic shuttling’. Außerdem gelang es erstmalig, Mengenunterschiede der Uhrengenproteine PER1 und CLOCK im humanen SCN im Tagesgang nachzuweisen. Sowohl bezüglich der AANAT als auch der Uhrengenproteine erfordern die in dieser Arbeit gefundenen Regulationsmechanismen keine de novo Proteinsynthese, um auf sich ändernde Umgebungsreize zu reagieren. Dadurch sind sie nicht nur zeitsparender, sondern auch weitaus energieeffizienter als die bei Nagern beobachteten Mechanismen. Es scheint, dass vor allem die schnelle und effiziente Reaktion auf sich verändernde Umweltbedingungen einen Selektionsvorteil für Ungulaten und Primaten bedeutet hat. Die in dieser Arbeit erhobenen Datensätze liefern neue Einblicke in die Regulation der Melatoninbiosynthese und der zirkadianen Rhythmik beim Menschen, und dienen dadurch dem besseren Verständnis von Regulationsmechanismen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.