Open Access

Ute Katrin Förster

• Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der konformationellen und elektronischen Eigenschaften sowie der Dynamik verschiedener RNA-Systeme. Zur Durchführung dieser Experimente wurde zusätzlich zu bereits vorhandenen statischen und zeitaufgelösten Absorptionsspektrometern im Rahmen dieser Arbeit eine Apparatur zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern entwickelt, die durch die integrative Verwendung zweier verschiedener, etablierter Technologien (TCSPC und Aufkonvertierung) über einen weiten Zeitbereich von 9 Größenordnungen (100 fs - 0,1 ms) operiert. Mit diesem Aufbau konnten neben den RNA-Studien wichtige Beiträge zum Verständnis der Isomerisierung eines Retinalproteins, des Transportprozess des Membrantransportproteins TbSMR und der im Infraroten liegenden Fluoreszenz des Radikalkations von Astaxanthin gewonnen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit liegt auf der Untersuchung verschiedener RNA-Systeme: So werden die optischen Eigenschaften einer 1-Ethinylpyren-modifzierten RNA-Adeninbase allein und in RNA-Strängen eingebunden untersucht. Statische Fluoreszenzmessungen zeigen einen ausgeprägten Ladungstransfercharakter des Chromophors und eine generell große Wechselwirkung zwischen Ethinylpyren und Adenin, die in einer substanziellen Änderung der optischen Eigenschaften des Pyrens resultiert. Die Untersuchung der schnellen Photodynamik von Pyrenadenin zeigt zudem eine Verringerung der Lebensdauer von Pyren um etwa 2 Größenordnungen. Pyrenadenin zeigt sowohl Fluoreszenz eines neutralen (100-200 ps), als auch eines energetisch tiefer liegenden Ladungstransferzustands (1-2 ns). Die Formationszeit des Ladungstransferzustandes fällt mit steigender Polarität des Lösemittels. Eingebunden in Modell-RNA-Stränge ist Fluoreszenzquantenausbeute des Chromophors ein deutlicher Indikator für seine Interkalation. Nur in der stabileren Umgebung von GC-Basenpaaren ist das Pyren in der Lage, sich dauerhaft innerhalb des Duplex aufzuhalten, während in einer flexibleren AU-Umgebung eine Position außerhalb des RNA-Duplex präferiert wird. Transiente Absorptionsmessungen zeigen, dass die Photophysik des in RNA eingebundenen Pyrenadenins nur kleine Variationen im Vergleich zur Photophysik des Labels allein aufweist. Die deutliche Abnahme der Quantenausbeute des interkalierten Chromophors geht hauptsächlich auf Kosten der langlebigeren Ladungstransferfluoreszenz, so dass interkaliertes Pyren insgesamt schneller in den Grundzustand zurückkehrt als nicht interkaliertes. Mit Hilfe eines doppelt modifizierten Duplex, bei dem sich jeweils ein Farbstoff an einem der beiden Stränge befindet, kann nachgewiesen werden, dass aufgrund von Exzimerwechselwirkungen eine Verschiebung des Fluoreszenzmaximums von 35 nm auftritt. Kurzzeitspektroskopische Messungen zeigen Signale, die als Superposition von Monomeren und Exzimeren interpretiert werden können, wobei die Lebensdauer des letzteren mit 18,5 ns die der Monomerkomponente um ein Vielfaches übertrifft. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit einer Studie zur Bindung des fluoreszenten Liganden Tetrazyklin an das Tetrazyklin bindende Aptamer. Hier wird auf Basis verschiedener Mutanten mit Hilfe des TCSPC eine Analyse der Stabilität der Bindetasche sowie mit der Stopped-Flow-Methode eine Beobachtung des Bindungsprozesses durchgeführt. Insgesamt folgt die Bindung des Tetrazyklins an das Aptamer einer zweistufigen Kinetik, deren zweiter Schritt irreversibel ist. Die Bindung läuft, verglichen mit anderen Aptameren, sehr schnell ab. Während die Mutationen von A13 und A50,die direkte Kontakte zum Substrat bilden, nur einen leichten Einfluss auf beide Bindungsschritte ausüben, führt eine Mutation der für die Präformation verantwortlichen Base A9 zu einer Verlangsamung des Bindungsprozesses um mehr als einen Faktor 20 durch eine immens gesteigerten Rückreaktionsrate des ersten Bindungsschritts. Hieraus lässt sich schließen, dass bei fehlender Präformation des Aptamers nur wenige Tetrazyklinmoleküle ein für vollständige Bindung geeignetes Aptamer vorfinden. Die Bindung an A13 und A50 geschieht bereits im ersten Schritt des Bindungsprozesses. Ferner konnte anhand von Lebensdauermessungen gezeigt werden, dass nach dem Wildtyp die Mutante A9G die stabilste Bindetasche aufwies. Das Fehlen eines direkten Kontaktes wirkt sich deutlich stärker aus. Insbesondere führt die Abwesenheit der Fixierung des Gegenions durch A50 zu der instabilsten Bindetasche. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, ist die zeitaufgelöste optische Spektroskopie insbesondere in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ein ausgezeichnetes Mittel zur Beobachtung von Struktur und Dynamik von RNA. Die Empfindlichkeit von Fluoreszenz auf die Veränderung der Umgebung des Chromophors erlaubt es, Konformationsdynamik und elektronische Konfigurationen in Echtzeit zu beobachten.
• This thesis treats the examination of the conformational and electronic properties, as well as the dynamics of various RNA systems. These experiments were carried out with static and time resolved absorption spectrometers, as well as with a newly developed fluorescence lifetime measurement setup. This setup operates over 9 orders of magnitude in time (100 fs – 0.1 ms) by applying two different established techniques (TCSPC and Upconversion) using the same hardware. With this setup, valuable contributions could be made to the study of the isomerisation of a retinal protein, the transport process of the membrane transporter TbSMR and the infrared fluorescence of the radical cation of astaxanthin. The focus of this thesis lies on the examination of various RNA-systems. The optical properties of a 1-ethynylpyrene-modified RNA-adenine-base, alone and incorporated into RNA strands, are examined. Static fluorescence measurements show a strong charge transfer character of the chromophore and a generally strong interaction between ethynylpyrene and adenine, which results in a substantial change of the optical properties of pyrene. The observation of the fast photodynamics of pyreneadenine shows a shortening of the overall lifetime of pyrene by 2 orders of magnitude. Pyreneadenine exhibits fluorescence of both a neutral (100-200 ps) and a energetically lower lying charge transfer state (1-2 ns). The formation time of the charge transfer state decreases with rising solvent polarity. Incorporated into model-RNA-strands, the fluorescence quantum efficiency of the chromophore is a significant indicator for its intercalation. Only in the more stable surrounding of GC-base pairs, pyrene is able to effectively remain within the duplex, while in a more flexible AU-surrounding, a position outside of the duplex is preferred. Transient absorption measurements show, that the photophysics of the pyreneadenine incorporated into RNA shows only small variations compared to that of the label alone. The strong decrease of quantum efficiency of the intercalated pyrene is mainly attributed to a quenching of the longer-lived charge transfer fluorescence. Thus, the ground state recovery of intercalated pyrene is faster than that of non-intercalated pyrene. With the aid of a doubly modified duplex, where a pyrene is located on each strand, it can be shown, that a shift of the fluorescence maximum of 35 nm occurs due to excimer interactions. Ultrafast spectroscopy shows signals, which can be interpreted as a superposition of monomer and excimer characteristics. The lifetime of the latter was found to be 18.5 ns and thus exceeds that of the monomer components by a multiple. The second part of this work discusses the binding of the fluorescent ligand tetracycline to the tetracycline binding aptamer. Here, on the basis of various mutants, an analysis of the stability of the binding pocket is carried out via TCSPC, and the stopped-flow method is used to monitor the binding process. Generally speaking, the binding of the tetracycline to the aptamer follows a two-step process with a irreversible second step. The binding is fast, compared to that of other aptamers. While the mutations of A13 and A50, which form direct contacts to the substrate, exert only small influences on both binding steps, indicating, that the binding to both bases occurs during the first binding step, the mutation of the base A9, which is responsible for the preformation, leads to a slowing of the binding process by a factor of 20, due to a strongly enhanced backreaction rate of the first step. This leads to the conclusion, that in this case, only few tetracycline molecules are able to find an aptamer, which is suited for complete binding. In addition to this, lifetime measurements showed, that of all mutants, the mutant A9G provides the most stable binding pocket. The mutation of direct contacts lead to more instable binding pockets, the least stable pocket is found in A50U. This may be due to the fact, that the attachment of the tetracycline counterion via A50 imposes the strongest restriction upon the flexibility of the tetracycline. This work shows, that time-resolved optical spectroscopy, especially together with fluorescent molecules, are a valuable tool for monitoring the structure and dynamics of RNA. The sensitivity of fluorescence on environmental factors allows the observation of conformational dynamics and electronic configurations in real time.