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Sanjeev Kumar Baniwal

• Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.
• Im Vergleich zu anderen eukaryotischen Organismen haben Pflanzen ein ungewöhnlich komplexes System der Streßantwort, das auch eine Familie mit mehr als 20 Regulatorproteinen, sog. Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsfs), einschliesst. Umfassende Untersuchungen zur funktionellen Diversifizierung der Hsfs sind bisher allerdings auf wenige Vertreter beschränkt (Hsfs A1, A2, A3, A9 und B1). Als Beispiel kann die funktionelle Triade von HsfA1, A2 und B1 in Tomate angeführt werden, die in typischer Weise die drei essentiellen Phasen einer Hitzestressantwort begleiten: (i) Auslösung der Antwort durch den Masterregulator HsfA1 einschliesslich der Neubildung von HsfA2 und HsfB1, (ii) Verstärkung der Genxepression bei einer Langzeitstressbelastung durch Kooperation von HsfA1 mit HsfA2 und B1 und schliesslich (iii) Wiederaufnahme der Haushaltsgenexpression in der Erholungsphase unter Mitwirkung von HsfB1. Die folgenden Ergebnisse über die Rolle von Hsfs A4 und A5 eröffnen eine ganz neue Sicht auf die Funktionsvielfalt von Hsfs. Beide Hsfs binden an die entsprechenden Promoterelemente (heat stress element, HSE); aber im Gegensatz zu der starken Aktivität von HsfA4 im Reporterassay in Tabakprotoplasten sind alle Vertreter der HsfA5 Gruppe inaktiv. Bei Coexpressionsexperimenten konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von HsfA5 die Aktivität von HsfA4 behindert. Nach allen Kriterien muss HsfA5 als ein spezifischer Repressor von HsfA4 bezeichnet werden. Durch in vitro Pull-down Experimente und Tests im Hefe-Zweihybridsystem konnte gezeigt werden, dass HsfA4 und HsfA5 eine starke Tendenz zur Bildung von Heterooligomeren haben, und diese werden in Tabakprotoplasten im Zellkern gefunden. Aus Datenbankuntersuchungen geht hervor, dass alle Pflanzen im allgemeinen zwei HsfA4 und einen HsfA5 haben. Bei Sequenzvergleichen finden sich die Mitglieder der HsfA4/A5 Gruppe klar getrennt von anderen Vertretern der Hsf Familie. Die Expression der Hsf A4 und A5 mRNA in verschiedenen Geweben von Tomate wurde durch RT-PCR und für Arabidospsis aus Daten international zugänglicher Mikroarrayanalysen ermittelt. Alle Vertreter sind im allgemeinen gut exprimiert, wenn auch der mRNA Spiegel in Abhängigkeit von Gewebe oder von Stressbehandlungen Schwankungen unterworfen ist. Die Bedeutung der Ergebnisse von HsfA4 als starkem Aktivator und HsfA5 als spezifischem Repressor der HsfA4 Funktion wird dadurch unterstrichen, dass durch Untersuchungen in Reis und Arabidopsis HsfA4 als antiapoptotischer Faktor in Verbindung mit oxidativem Stress gekennzeichnet wurde. Die starke Konservierung innerhalb der HsfA4/A5 Gruppe macht wahrscheinlich, dass es sich um ein allgemeines Phänom bei Pflanzen handeln könnte. Allerdings müssen die biologischen Details unter Einbeziehung transgener Pflanzen mit knock-out bzw. Überexpression dieser Hsfs noch geklärt werden.