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Chiral-Pool-Synthesen von nicht-natürlichen Aminosäuren: Neue Bausteine für RNA-Liganden

  • In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
  • During the last 25 years of HIV research several drugs have been developed to suppress the outbreak of the AIDS disease. What all these pharmaceuticals have in common is that they address regulatory proteins of the HIV life cycle. Due to their important role in many biochemical processes, RNA is considered an interesting drug target. Its various secondary and tertiary structures offer binding sites for proteins, antibiotics, and other small molecules. These binding interactions between RNA and the ligand, e.g. a peptide, are governed by hydrogen bonds, Coulomb forces and -stacking. In nature only four different aromatic amino acids exist. Our concept to discover peptidic RNA ligands was to start from a broader range of building blocks capable to undergo stacking with nucleobases. Towards this aim, we developed the synthesis of artificial amino acids with aromatic moieties. In this project (L)-methionine and (L)-glutamic acid are used as chiral starting materials, depending on the required chain length (C2-linker for Met, C3-linker for Glu). The key step in both syntheses is a transition metal catalysed C􀃭C-coupling reaction, either the Heck reaction employed in the methionine route or the Negishi reaction for the glutamic acid route. With both procedures ten steps are required to prepare Fmoc-protected -amino acids. The non-natural building blocks are combined with natural amino acids to construct peptide libraries, either by combinatorial or by parallel solid phase synthesis. Homogeneous in vitro assays are used to identify good RNA binders. All selected peptides are initially tested for affinity to the trans-activation responsive element (TAR) of HIV-1. The competition assay employed in this test makes use of a dye labelled Tat-peptide, which is displaced from TAR by the ligand in question. In the case of pyrene peptides their autofluorescence allows direct determination of binding constants. With tripeptide 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) a promising compound has been identified. In experiments with HIV-1-infected HeLa P4 (IC50 = 125 microM) and MT-4 (EC50 = 46 microM) cells the antiviral property of 172 has been demostrated. Furthermore, peptide 172 was tested successfully as antimicrobial peptide amongst others against B. subtilis (MIC = 22 microM) and S. aureus (MIC = 31 microM).

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Metadaten
Author:Marcel Suhartono
URN:urn:nbn:de:hebis:30-63291
Referee:Michael W. Göbel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/04/30
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2008/10/31
Release Date:2009/04/30
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung. Die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:416831141
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
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