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Peptidomimetische Bausteine für synthetische RNA-Liganden

Peptidomimetic building blocks for artificial RNA ligands

  • Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
  • A prominent example for regulatory RNA-protein interactions is the complex of HIV-1 TARRNA and the viral protein Tat. This complex is crucial for the efficient transcription of viral genes. Essential for the recognition of the RNA Stem-Loop structure is the interaction of Tat with the three-nucleotide bulge of TAR. Knowing the principles of the Tat-TAR recognition should allow to design specific ligands which may be useful as antiviral Tat antagonists. The aim of this work was to synthesize a broad scope of heteroaromatic building blocks for RNAligands. The heteroaromatic moieties could be attached to Fmoc-protected (2-aminoethyl)glycine-backbone via amide bonds. The peptidomimetic building blocks X were then used in SPPS to generate tripeptides of the general pattern Arg-X-Arg and variations with lysine. The binding affinities of tripeptides to the TAR RNA of HIV-1 were determined in fluorescence based experiments. The first assay applies a Tat peptide doubly labelled with fluoresceine and a quencher. Upon displacement from TAR by a competing ligand this peptide undergoes a conformational change leading to pronounced quenching of light emission. Tripeptides H2N&-(D)Arg-lactame-(D)Arg-CONH2 (154) and H2N-(D)Arg-amidine- (D)Arg-CONH2 (158) exhibited IC50 values in the range of 2-3 microM, which were approved by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). In mass spectroscopic studies of the tripeptide 158 and Tat respectively with TAR-RNA stoichiometries of 1:1 and 1:2 were observed. The HeLa P4 assay demonstrated the antiviral properties of 158 (IC50 = 10-50 microM). NMR studies and molecular dynamics calculations exhibit a conformational change of TAR-RNA upon interaction with guanidinium groups. One further goal of this work was the synthesis ofdiaminopyrazoles and indazols to verify the binding concept, which is based on conformational studies of TAR-RNA. Protonated diaminopyrazoles with small residues and protonated triaminopyrazole surpass the dicationic ligand arginine amide. In accordance with the binding model, protonated aminopyrazoles behave as “super-guanidines“ with respect to TAR-RNA. The reduced and protonated form of a triaminopyrazole embedded into the phenazine-like framework is not planar but lipophilic and should be able to form additional hydrogen bonds. The exchange of the nitrogen into oxygen in the ring system of phenazine should stabilize the reduced form. Unfortunably the reduced phenazine derivative easily decomposes. Therefore no further investigations will take place.

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Metadaten
Author:Sven Thomas Breitung
URN:urn:nbn:de:hebis:30-73098
Referee:Michael W. Göbel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/01/25
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/09/25
Release Date:2010/01/25
HeBIS-PPN:22046247X
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht