Open Access

Helena Frey

• The small leucine-rich proteoglycan biglycan (Bgn) is a part of the extracellular matrix providing structure and enhancing fibril stability. In its soluble form, biglycan is able to bind and signal via the innate immune receptors Toll-like receptor (TLR) 2 and 4, thereby activating MAP-kinases and the NF-κB pathway. In macrophages soluble biglycan induces the secretion of several cytokines and chemokines, including TNF-α, CCL2, CXCL5 and CXCL13. A unique feature of biglycan is its ability to stimulate the secretion of mature IL-1β. By orchestrating TLR2 and 4 with the purinergic P2X4 and P2X7 receptor signalling biglycan triggers the activation of the NLRP3/ASC inflammasome, which in turn activates caspase-1 to cleave pro-IL-1β to mature IL-1β. Furthermore, in several inflammatory diseases an upregulated biglycan expression is found. Enhanced levels of biglycan could be measured in plasma and inflamed tissue. In mouse models of sepsis, lupus nephritis and renal ischemic reperfusion injury, biglycan-deficiency improved the disease outcome. Overexpression of soluble biglycan on the other hand increased immune cell infiltration into the kidney by inducing cytokine and chemokine expression in a TLR2/4-dependent manner. These studies emphasise its importance in inflammatory processes, especially in the kidney. Furthermore, the pro-inflammatory effects on macrophages and diseases established biglycan as a danger signalling molecule, yet its role as a soluble molecule in plasma was not further investigated. Although an increase of soluble biglycan in the circulation could be seen in several inflammatory diseases, the source is not fully unravelled. Previously it could be shown that macrophages and dendritic cells secrete soluble biglycan after stimulation with IL-6 and TGF-β1. However, since these cell are resident in organs and do not circulate in the blood stream their contribution to soluble biglycan levels in plasma is likely minor. Therefore, monocytes as precursor of both macrophages and dendritic cells were investigated as a possible source of circulating biglycan. Analysis of blood from septic patients revealed elevated soluble biglycan levels as well as an increased number of monocytes. Isolated monocytes from healthy volunteers incubated with the inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TGF-β1 displayed increased biglycan mRNA expression and secretion of soluble biglycan into the supernatant, revealing monocytes as a producer of soluble biglycan in blood. Therefore this work was directed to further investigate the influence of soluble biglycan on circulating monocytes, with regard to sepsis. Monocytes can be classified into three subtypes, while the classical monocytes express CD14 (CD14++CD16low), intermediate monocytes express both CD14 and CD16 (CD14++CD16+) and non-classical monocytes express mainly CD16 (CD14lowCD16++). The intermediate and non-classical monocytes make up about 10 % of all monocytes and are referred to as CD16-positive subtypes. The CD16-positive monocytes express higher levels of TNF-α and IL-1β upon stimulation and display different migration behaviour. In most inflammatory diseases an expansion of CD16-positive monocytes is observed, especially an increased number of intermediate monocytes frequently correlate with disease severity and mortality. Since septic patients had increased circulating biglycan levels and augmented CD16-positive monocytes, a possible correlation between these two parameters was investigated. Using FACS analysis of biglycan-stimulated monocytes from healthy donors revealed a significant shift from classical to intermediate and non-classical monocytes. This shift was mediated by increased expression of CD14 and CD16 on mRNA and protein levels upon biglycan treatment. Furthermore, biglycan induced the mRNA expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1 and ELAM-1 in CD14-positive monocytes. Four hours after biglycan stimulation an increased ICAM-1 protein expression on the cell surface of classical and intermediate monocytes was observed. Additionally, biglycan-treated CD14-positive monocytes rolled and attached to pre-stimulated endothelial cells to a greater extent compared to untreated monocytes. This demonstrates that biglycan not only triggers the expression of CD14 and CD16 but also induces a functional shift of monocytes. ...
• Das kleine leucin-reiche Proteoglykan Biglycan (Bgn) ist ein Teil der extrazellulären Matrix, welches Struktur und eine erhöhte Faserstabilität verleiht. Als lösliches Molekül kann Biglycan an die Rezeptoren der angeborenen Immunität Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4 binden, wodurch es die MAP-Kinasen und den NF-κB Signalweg aktiviert. In Makrophagen induziert Biglycan die Sekretion mehrerer Zytokine und Chemokine wie TNF-α, CCL2, CXCL5 und CXCL13. Durch das Zusammenspiel von TLR2 und 4 mit den purinergen Rezeptoren P2X4 und P2X7 löst Biglycan die Aktivierung des NLRP3/ASC Inflammasoms aus, welches seinerseits Caspase-1 aktiviert die pro-IL-1β zu reifem IL-1 β spaltet. Des Weiteren ist in mehreren entzündlichen Erkrankungen die Biglycanexpression hoch-reguliert und erhöhte Werte von löslichen Biglycan im Plasma und entzündetem Gewebe wurden gefunden. Es konnte gezeigt werden, dass eine Biglycandefizienz den Ausgang einer Sepsis, Lupus Nephritis und renalen ischämischen Reperfusion positive beeinflusst. Andererseits erhöhte die Überexpression von Biglycan durch die Induzierung von Zytokinen und Chemokinen in einer TLR2/4-abhängigen Weise, die Immunzellinfiltration in die Niere, was dessen Wichtigkeit in Entzündungsreaktionen, vor allem in der Niere, unterstreicht. Diese pro-inflammatorischen Eigenschaften bei Makrophagen und in Krankheiten etablierten Biglycan als ein gefahren-signalisierendes Molekül, dessen Rolle als lösliches Molekül im Plasma bisher jedoch nicht weiter untersucht worden ist. Obwohl in mehreren entzündlichen Erkrankungen erhöhte Spiegel von löslichem Biglycan festgestellt wurden, ist dessen Quelle nicht vollständig geklärt. Zuvor konnte gezeigt werden, dass sowohl Makrophagen, als auch dendritische Zellen nach Stimulation mit IL-6 und TGF-β1 lösliches Biglycan sezernieren. Da sich diese Zellen jedoch im Gewebe und nicht in der Zirkulation befinden, ist deren Beitrag zum löslichen Biglycan im Blutstrom vermutlich gering. Daher wurden ihre Vorläuferzellen, die Monozyten, als potentielle Biglycanproduzenten untersucht. Blutanalysen von septischen Patienten zeigten erhöhte Spiegel von löslichen Biglycan, als auch eine Zunahme der Monozytenanzahl. Isolierte Monozyten von gesunden Probanden wurden mit den inflammatorischen Zytokinen IL-1β, IL-6 und TGF-β1 inkubiert. Stimulierte Monozyten wiesen sowohl eine erhöhte mRNA Expression, als auch Sekretion von Biglycan auf und stellen damit eine Quelle von löslichem Biglycan im Blutkreislauf dar. Basierend auf diesen Ergebnissen konzentrierte sich die vorliegende Arbeit auf den Einfluss von löslichem Biglycan auf zirkulierende Monozyten, hinsichtlich einer Sepsis. Es gibt drei Arten von Monozyten. Die klassischen Monozyten exprimieren CD14 (CD14++CD16low), die Intermediären exprimieren CD14 und CD16 (CD14++CD16+) und die Nicht-klassischen exprimieren überwiegend CD16 (CD14lowCD16++). Die intermediären und nicht-klassischen Monozyten machen etwa 10 % der gesamten Monozyten aus und werden als CD16-positive Monozyten bezeichnet. CD16-positive Monozyten produzieren mehr TNF-α und IL-1β und unterscheiden sich auch in ihrem Migrationsverhalten. In vielen entzündlichen Erkrankungen ist der Anteil an CD16-positiven Monozyten erhöht und vor allem die Anzahl an intermediären Monozyten korreliert häufig mit dem Schweregrad und der Sterblichkeit einer Erkrankung. Da septische Patienten sowohl erhöhte Biglycankonzentrationen, als auch mehr CD16-positive Monozyten aufwiesen, wurde ein möglicher Zusammenhang der beiden Parameter ermittelt. Untersuchungen von biglycan-stimulierten Monozyten mittels FACS zeigten eine signifikante Verschiebung von klassischen hin zu intermediären und nicht-klassischen Monozyten. Lösliches Biglycan förderte diese Verschiebung durch Induzierung der Expression von CD14 und CD16 auf mRNA- und Proteinebene. Des Weiteren stimulierte lösliches Biglycan die mRNA Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und ELAM-1 in CD14-positiven Monozyten. Die ICAM-1 Expression konnte bereits 4 h nach Stimulation mit löslichem Biglycan auch auf der Zelloberfläche von intermediären und nicht-klassischen Monozyten beobachtet werden. Zusätzlich rollten und hafteten mehr biglycan-stimulierte CD14-positive Monozyten an vorstimulierten Endothelzellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Biglycan nicht nur die Expression von CD14 und CD16, sondern auch einen funktionellen Wechsel von Monozyten induziert. ...