Open Access

Chenguang Zhao

• The transporter associated with antigen processing-like (TAPL) acts as a lysosomal ATP-dependent polypeptide transporter with broad length selectivity. To characterize in detail its substrate specificity, a procedure for solubilization, purification and functional reconstitution of human TAPL was developed. TAPL was expressed in Sf9 insect cells with the baculovirus expression system and solubilized from crude membranes. By intensive screening of detergents, the mild non-ionic detergents digitonin and dodecylmaltoside were found to be ideal for solubilization with respect to efficiency, long term stability, and functionality of TAPL. TAPL was isolated in a two-step procedure with a yield of 500 micro g/L cell culture and, subsequently, reconstituted into proteoliposomes. The KM(pep) for the peptide RRYCfKSTEL (f refers to fluorescence label) and KM(ATP) were determined to be 10.5 ± 2.3 micro M and 97.6 ± 27.5 micro M, respectively, which are in the same range as the Michaelis-Menten constants determined in the membranes. The peptide transport activity of the reconstituted TAPL strongly depends on the lipid composition. Interestingly, the E. coli lipids are prefered over other tested natural lipids extracts. Moreover, phosphatidylcholine, the most abundant phospholipid in eukaryotic cells influenced TAPL activity in a dose dependent manner. In addition, some negatively charged lipids like DOPA and DOPS increased peptide transport activity with preference for DOPS. However, DOPE or egg PG which are also negatively charged had no effect. It seems not only the charge but also the specific head group of phospholipids that has impact on the function of TAPL. With the help of combinatorial peptide libraries containing D-amino acid residues at defined positions as well as bulky fluorescein labeled peptides, the key positions of the peptides were localized to the N- and C-terminal residues with respect to peptide transport. The C-terminal position has the strongest selectivity since modification at this position shows strongest impact on peptide transport. Additionally, positions 2 and 3 of the peptide also have weak influence on peptide selectivity. Subsequently, the residue preferences at the key positions were systematically investigated by combinatorial peptide libraries with defined residues at certain positions. At both ends, TAPL favors positively charged, aromatic, or hydrophobic residues and disfavors negatively charged residues as well as asparagine and methionine. The residue preferences at the key positions are valid for peptide substrates with different length, indicating a general rule for TAPL selectivity. Besides specific interactions of both terminal residues, electrostatic interactions are important, since peptides with positive net charge are more efficiently transported than negatively charged ones. By size exclusion chromatography (SEC) and blue native PAGE, TAPL purified in the presence of digitonin or dodecylmaltoside had an apparent molecular weight of 200 kDa which is close to the theoretical molecular mass of the TAPL homodimer (172 kDa). The purified and reconstituted TAPL showed specific ATP hydrolysis activity which can be inhibited by orthovanadate. TAPL in proteoliposomes showed 6-fold higher ATP hydrolysis than digitonin solubilized protein, indicating the phospholipids impact on TAPL function. However, no peptide substrate stimulated ATPase activity was observed. For site-specific labeling of TAPL, eight cysteines in each half transporter were replaced by alanine or valine. The TAPL cys-less mutant showed the same peptide transport activity as TAPL wt. Based on the functional TAPL cys-less mutant, seven single cysteine mutants were introduced into strategic positions. All single cysteine mutants in the TMD did not influence peptide transport, whereas the mutant L701C, which is close to the conserved H-loop motif, displayed impaired transport. TAPL orthologs Haf-4 and Haf-9 from Caenorhabditis elegans possess around 40% sequence identities with TAPL and 50% with each other. Both proteins are putative half transporters and reported to be involved in the intestinal granule formation (Bauer, 2006; Kawai et al., 2009). To further understand the physiological functions of these two proteins, they were expressed in Sf9 insect cells. Haf-4 and Haf-9 showed weak but specific ATP- and peptide-dependent peptide transport activity for the given peptide RRYCfKSTEL. Therefore, it was proposed that the physiological roles for Haf-4 and Haf-9 might be related to their peptide transport activity. Besides forming functional homodimeric complex as estimated by the peptide transport activities, both half transporter could also form heteromers which was confirmed by coimmunoprecipitation. However, the heteromers showed decreased transport activity.
• Der humane ABC Transportkomplex ABCB9 wurde als lysosomaler Polypeptidtransporter identifiziert. ABCB9 hat eine hohe Sequenzidentität zu TAP1 ("transporter associated with antigen processing 1") und TAP2 und wird deshalb "TAP-Like" (TAPL) genannt. In lysosomalen Membranen organisiert sich TAPL als Homodimer, wobei sich das Monomer aus der N-terminalen Transmembrandomänen mit 10 putativen Transmembranhelices fusioniert mit der C-terminalen Nukleotidbindedomänen zusammensetzt. Von humanem TAPL wurden Orthologe in Invetrebraten, wie Caenorhaditis elegans und Pflanzen, nachgeweisen, was auf ein hohes evolutionäres Alter von TAPL hindeutet. Humanes TAPL wird in verschiedenen Geweben exprimiert, u.a. im Herz. Die zentrale Frage auf dem TAPL-Forschungsgebiet beschäftigt sich momentan damit, die physiologische Bedeutung aufzuklären. Um diese Fragestellung beantworten zu können ist die Kenntnis der Substratspezifität von essentieller Bedeutung. Die Ziele meiner Doktorarbeit waren (i) die funktionale Solubilisierung, Reinigung und Rekonstitution von humanem TAPL in Liposomen. (ii) Des weiteren sollte die Substratspezifität detailliert entschlüsselt werden. (iii). Die Generierung und Charakterisierung einer Cystein-freien TAPL Variante sollte den Grundstein legen, um den Translokationsmechanismus und die Struktur aufzuklären. (iv) Weiterhin sollten Orthologe von TAPL aus Caenorhabditis elegans, biochemisch charakterisiert. Da es nicht möglich war, an isolierten TAPL-haltigen Membranen die Substratspezifität von TAPL zu entschlüsseln, wurde eine Prozedur bestehend aus Expresssion in Sf9 Insektenzellen, Solubilisierung, Reinigung und funktionaler Rekonstitution in Liposomen etabliert. Durch intensives "Screening" von Detergenzien zur Solubilisierung von TAPL kristallisierten sich die nicht-ionischen Detergenzien Digitonin und n-Dodecyl-ß-D-maltosid (DDM) bezüglich Langzeitstabilität und Funktionalität von TAPL heraus. Nach Solubilisierung wurde TAPL in einem zwei Stufen Prozess, bestehend aus Kationenaustauscher und Metall-Affinitätschromatographie gereinigt. Der Oligomerisierungszustand von TAPL in der Digitionin- bzw. DDM-Mizelle wurde durch Größenausschlußchromatographie und "blue native" PAGE untersucht. TAPL bildete einen Komplex mit einem apparenten Molekulargewicht von 200 kDa aus, was auf einen Homodimer mit einem theoretischen Molekulargewicht von 172 kDa hinweist. Zur Charakterisierung des Peptidtransports wurde eine Rekonstitution von TAPL in Liposomen etabliert. Nach der funktinonalen Rekonstitution wies TAPL die gleichen kinetischen Parameter wie TAPL in Membranen von Insektenzellen auf. Für den Peptidtransport konnte eine starke Abhängigkeit für die Lipidzusammensetzung detektiert werden. Interessanterweise stellten sich Lipide von E. coli im Vergleich zu Lipidextrakten aus Säugerzellen als bevorzugt heraus. Des weiteren zeigte sich, dass Phosphatidylcholin, das meist verbreitete Lipid in eukaryontischen Zellen, einen Dosisabhängigen Effekt auf die Transportaktivität von TAPL hat. Die höchste Peptidtransporteffizienz wurde in Liposomen bestehend aus 70% E .coli Lipidextrakt und 30% (w/w) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) nachgewiesen, höhere Konzentationen von DOPC reduzierten die Pepitdtransporteffizienz. Rekonstitutiertes TAPL zeigte eine spezifische ATP-Hydrolyseaktivität, welche durch ortho-Vanadat inhibiert werden konnte. Des Weiteren konnte eine durch Peptid stimulierte ATP-Hydrolyseaktivität nicht nachgewiesen werden. Nach funktionaler Rekonstitution und Charakterisierung von TAPL in Liposomen wurden mit Hilfe von kombinatorischen D-Amino Peptidbibliotheken die Schlüsselpositionen für die Substraterkennung identifiziert. Die C-terminale Position innerhalb des Peptids hat den stärksten Einfluss auf die Substraterkennung, da kovalente Modifikationen den Peptidtransport drastisch reduzieren. Zusätzlich wiesen die N-terminalen Positionen 2 und 3 einen Einfluss auf die Peptidselektivität auf. Die weitere Charakterisierung der Schlüsselpositionen mittels detaillierten Peptidbibliotheken ergab, dass TAPL sowohl bei der N- als auch bei der C-terminalen Position positiv geladene, aromatische oder hydrophobe Aminosäuren bevorzugt. Negativ geladene Aminosäuren sind nicht präferiert. Diese Selektivitätsregel für die Peptiderkennung durch TAPL konnte für Peptide mit verschiedener Länge verifiziert werden. Ein wichtiger Grundstein, um den Translokationsmechnismus und die Struktur von TAPL aufzuklären, ist die Generierung einer Cystein-freien TAPL Variante. Durch gezielte Mutagenese wurden acht Cysteine im TAPL Monomer ersetzt. Die Cystein-freie TAPL Mutante zeigte eine gleiche Peptidtransportaktivität wie TAPL Wildtyp. Nach der Gewährleistung der Funktionalität von Cystein-freiem TAPL wurden einzelne Cysteine an strategischen Positionen wieder eingeführt. Die eingeführten Cysteine hatten keinen Einfluss auf die Expression und den Peptidtransport. Eine Ausnahme bildete die TAPL-Variante L701C, welche nahe der konservierten H-Schleife in der NBD lokalisiert ist und eine signifikant reduzierte Transportaktivität aufweist. Die orthologen TAPL Varianten in Caenorhabditis elegans, Half-4 und Haf-9, besitzen eine Sequenzidentität von 40% mit humanem TAPL. Für eine detaillierte Charakterisierung der physiologischen Funktion und deren Substrate wurden Half-4 und Haf-9 in Sf9-Insektenzellen exprimiert. Beide Proteine transportieren in Abhängigkeit von ATP das Modelpeptid. Interessanterweise scheinen diese Halbtransporter sowohl als Homodimere wie auch als Heterodimere die Funktion als Peptidtransporter erfüllen zu können.