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Susann Henke

• In dieser Arbeit wurde das Hauptkapsidprotein VP1 des murinen Polyomavirus zum Transfer von DNA in eukaryontische Zellen eingesetzt. Das murine Polyomavirus wird der Familie der Papovaviridae zugeordnet. Die Viren dieser Familie sind durch nichtumhüllte, ikosaedrische Kapside gekennzeichnet. Die äußere Hülle wird aus 72 VP1­Pentameren gebildet, an die sich intern je ein VP2­ bzw. VP3­Molekül anlagert. Das Strukturprotein VP1 ist aufgrund folgender Eigenschaften für eine DNA­Beladung und Transfektion in eukaryontische Zellen prädestiniert: 1. Es wurde am N­Terminus von VP1 eine DNA­Bindungsdomäne identifiziert. 2. Es konnte am N­Terminus von VP1 eine Kernlokalisationssequenz nachgewiesen werden. 3. Es wurde die exakte Rezeptorerkennungssequenz innerhalb der VP1­Struktur bestimmt. 4. VP1 ist in der Lage, nach einer rekombinanten prokaryontischen Expression unter Hochsalzbedingungen zu Kapsoiden zu assemblieren. In dieser Arbeit wurde ein rekombinantes, in E. coli exprimiertes VP1­Protein verwendet und hinsichtlich seiner DNA­Bindung und der Fähigkeit zum DNA­Transfer in eukaryontische Zellen charakterisiert: 1. Das vorhandene Aufreinigungsprotokoll konnte optimiert werden. Die Proteinausbeute aus 1 l Bakteriensuspension wurde von 1,8 mg auf 3 mg gesteigert. Gleichzeitig wurde die Kontamination mit Fremdprotein deutlich reduziert. Es konnten die Ergebnisse hinsichtlich der Kapsoidassemblierung unter Hochsalzbedingungen reproduziert werden. 2. Cytotoxizitätstests in NIH 3T3­Zellen belegten, daß die getesteten VP1­Kapsoid­ Konzentrationen (ca. 25 µg/ml) keine signifikanten Anzeichen einer toxischen Reaktion zeigten. 3. Der Vergleich zwischen dem Kapsoid ohne His­Tag und mit His­Tag (N­terminale Klonierung eines 6xHis­Affinitäts­Tags) zeigte, daß durch den His­Tag die Bindung von einzelsträngiger DNA an das Kapsoid von 37% auf 55% erhöht werden konnte. Es wurde aber auch eine konzentrationsabhängige Aggregation des VP1­Proteins mit His­Tag beobachtet. In späteren Arbeiten wurde aus diesem Grund bevorzugt das VP1­Protein ohne His­Tag eingesetzt. 4. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine Transfektion von eukaryontischen Zellen, in diesem Fall den NIH 3T3­Zellen, mit rekombinanten VP1­Kapsoiden nachgewiesen werden. Nach Beladung von VP1­Kapsoiden mit fluoreszenzmarkierter einzelsträngiger DNA konnte eine eindeutige intrazelluläre Fluoreszenz in den NIH 3T3­Zellen beobachtet werden. Diese Fluoreszenz war diffus im Cytoplasma und distinkt im Nukleus lokalisiert. 5. Die biologische Aktivität der über VP1 in die Zelle transportierten einzelsträngigen DNA­Sequenzen wurde mit einer Reduktion der bcl­2­Expression in MOLT­4­ Zellen überprüft. Die VP1­Kapsoide zeigten im Vergleich zu DOTAP als Transfersystem und Aufnahme freier einzelsträngiger DNA die höchste Antisense­ Wirkung. Die verwendeten modifizierten Oligodesoxynukleotide zeigten jedoch eine nicht­sequenzspezifische Reduktion des Proteinlevels. 6. Nach Beladung von VP1­Kapsoiden mit Plasmid­DNA unter Hochsalzbedingungen konnte in Transfektionsversuchen der erfolgreiche Transport der verwendeten Plasmid­DNA in den Nukleus der Zielzelle über die Expression des Markergens (EGFP) nachgewiesen werden. 7. Im Hinblick auf eine Verbesserung der Transfektionseffizienz wurde die Beladung von VP1 mit DNA­Kondensaten getestet. Nach Einsatz von Histonen für eine DNA­Komplexierung wurden Partikel detektiert, die vor allem aufgrund ihrer Größe nicht für eine Beladung mit VP1 geeignet waren. Als ein zweites Kondensationsagenz wurden polykationische Polyamidoamine, auch Dendrimere genannt, untersucht. Nach Einsatz von kondensierter, fluoreszenzmarkierter doppelsträngiger DNA konnte zusammen mit VP1­Pentameren eine wesentlich stärkere Fluoreszenz innerhalb des Cytoplasmas der transfizierten Zellen im Vergleich zur Transfektion von Dendrimer­DNA­Kondensaten ohne VP1 nachgewiesen werden. Es konnte jedoch in keinem getesteten Kondensationsansatz in Anwesenheit von VP1 ein Transport der eingesetzten Plasmid­DNA zum Nukleus der eukaryontischen Zellen beobachtet werden.