Open Access

Julia Voelcker

• Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung der Genexpression der axonalen wachstumsassoziierten Proteine NAP-22, GAP-43 und CAP-23 in den dopaminergen Neuronen der Substantia nigra pars compacta (SNc), einer im Mesencephalon gelegenen Zellregion, relativ zu der Genexpression eines Referenzgens. Als Versuchstiere dienten sechs Monate alte, männliche CB6F1 Wildtypmäuse sowie sechs Monate alte, männliche CAP-23 transgene (CAP-23tg) Tiere, die das wachstumsassoziierte Protein CAP-23 überexprimieren. Die dopaminergen Zellen der SNc wurden zunächst morphologisch charakterisiert und ihre Ausdehnung im Mittelhirn durch alternierende Immunfärbungen der Tyrosinhydroxylase, einem Schlüsselenzym der Dopaminsynthese, sowie Toluidinblaufärbungen ermittelt. Anschließend wurden die Neurone durch die Methode der Lasermikrodissektion (LMD) im Zellverband isoliert. Hierfür war die Optimierung der Toluidinblaufärbung erforderlich, mit dem Ziel, sowohl eine gute Färbung der Neurone als auch eine hohe RNA-Nativität zu erzielen. Die RNA wurde isoliert und nach Integritätsprüfung in cDNA umgeschrieben. Daraufhin erfolgte die Analyse der Genexpression der beschriebenen Gene durch die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dabei war feststellbar, dass das Transgen Cap-23 in den transgenen Tieren stärker exprimiert wird als das Endogen Nap-22. Es zeigte sich jedoch kein signifikanter Unterschied der Expression von endogenem Nap-22 und endogenem Gap-43 in den CAP-23tg Tieren im Vergleich zu der Expression in den Wildtypmäusen. Das bedeutet, dass die Überexpression von Cap-23 in den transgenen Tieren die Expression der mRNA der beiden endogenen wachstumsassoziierten Proteine NAP-22 und GAP-43 nicht beeinflusst. Auf Grundlage der in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse soll in Folgeexperimenten untersucht werden, inwieweit die Überexpression von CAP-23 die Reorganisationsfähigkeit dopaminerger Neuronen der SNc nach einer Schädigung beeinflusst, wie sie zum Beispiel beim Menschen im Verlauf des Morbus Parkinson beobachtet wird.
• Subject of this study is the analysis of gene expression of the axonal growth-associated proteins NAP-22, GAP-43 and CAP-23 in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNc) relative to the expression of a reference gene. The experiments were carried out in six months old male CB6F1 wild-type mice and six months old male CAP-23 transgenic (CAP-23tg) mice overexpressing the axonal growth-associated protein CAP-23. Dopaminergic cells in the SNc were identified using immunostaining for tyrosine hydroxylase, a key enzyme in dopamine synthesis, and toluidine blue staining on alternating sections of the midbrain. After their unequivocal characterization, dopaminergic neurons were isolated by laser capture microdissection (LMD). In order to achieve good neuronal labeling as well as a high nativity of the harvested RNA, the toluidine blue staining had to be optimized. Following harvesting of the tissue, RNA was isolated, analyzed for integrity and transcribed into cDNA. Gene expression analysis was performed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). It could be shown that in transgenic animals the expression of the transgenic Cap-23 was stronger than the expression of the endogenous Nap-22. No significant difference in the expression of Nap-22 and Gap-43 could be detected in the CAP-23tg mice compared to wild-type mice. From these results it can be concluded that the overexpression of Cap-23 does not affect the expression of the mRNA of the two endogenous growth-associated proteins NAP-22 and GAP-43 in the transgenic animals. Based on these results, future experiments will be performed which will investigate whether the overexpression of CAP-23 affects the ability of dopaminergic neurons to reorganize their axons after lesion, as it occurs in Parkinson's disease in humans.