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Sonja Kuhlmann

• TeaABC from the halophilic bacterium Halomonas elongata belongs to the family of tripartite ATP-independent periplasmic (TRAP) transporters. It facilitates the uptake of the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine which protect the cell from dehydration by accumulating in the cytoplasm during hyperosmotic stress. It is the only known TRAP transporter activated by osmotic stress. Ectoine and hydroxyectoine accumulation in H. elongata is regulated by the cytoplasmic universal stress protein TeaD. The gene encoding TeaD is located in the same operon as the TeaABC gene. TeaD regulates the cellular homeostasis of ectoine possibly by interacting directly or indirectly with TeaABC. All subunits of TeaABC and TeaD were expressed in E. coli and purified. With TeaD and the solute binding protein (SBP) TeaA high levels of expression suitable for crystallization could be obtained and their 3D structures solved. The small transmembrane protein TeaB and the transporter TeaC showed only moderate and low levels of expression respectively. Functional analysis on TeaA was performed using Isothermal Titration Calorimetry. The measurements demonstrate that TeaA is a high affinity ectoine-binding protein (Kd = 0.19 _M) that also has a significant affinity for hydroxyectoine (Kd = 3.8 _M). The structure of TeaA was solved using ab initio phase determination by MAD (multiple anomalous dispersion). TeaA structures were determined in three conformations: TeaA alone, TeaA in complex with ectoine and TeaA in complex with hydroxyectoine. The resolutions of the structures were 2.2, 1.55 and 1.80 Å, respectively. These represent the first structures of an osmolyte SBP associated to a TRAP transporter. The structures reveal similar ligand binding compared to osmolyte SBPs of ABC transporter pointing to coevolution of the ligand binding modes. Moreover, unique features such as the solvent-mediated specific binding of the ligands ectoine and hydroxyectoine could be observed for TeaA. The structure of TeaD in complex with its cofactor ATP was solved by molecular replacement at a resolution of 1.9 Å. Comparison with other structures of universal stress proteins shows striking oligomerization and ATP binding in TeaD. In conclusion, this work presents the first detailed analysis of the molecular mechanisms underlying ligand recognition of an osmoregulated transporter from the TRAP-transporter family.
• Das halophile Proteobakterium Halomonas elongata kann in Salzkonzentrationen von 0,5 - 5 M NaCl überleben (Vreeland, 1992). H. elongata ist durch verschiedene Mechanismen an hohe und wechselnde Salzkonzentrationen angepasst. Eine zentrale Rolle spielt dabei Ectoin, ein neutral geladenes Aminosäurederivat. Ectoin wird bei Salzstress in hoher Konzentration im Cytoplasma eingelagert, erhöht dessen chemischen Wert und verhindert somit den Wasserverlust der Zelle. TeaABC ist der einzige Ectoin Transporter in H. elongata und besitzt eine hohe Affinität zu Ectoin (Grammann et al., 2002). Der Transporter TeaABC besteht aus drei Proteinen (Grammann et al., 2002). Mit TeaB (22 kDa) und TeaC (45 kDa) besitzt das Transportsystem zwei Transmembrankompetenten. TeaC stellt dabei die Transporteinheit dar, während die Funktion von TeaB noch unbekannt ist. TeaA ist ein 36 kDa periplasmatisches Solut Bindeprotein (SBP) für Ectoin (Tetsch and Kunte, 2002). Ein offener Leserahmen stromabwärts von teaC, das auch zum teaABC Operon gehört, kodiert für ein cytoplasmatisches Protein mit einem Molekulargewicht von 16 kDa. Dieses Protein wurde TeaD benannt und gehšrt zu der Familie der Universellen-Stress-Proteine (USP). Während teaA, teaB und teaC für den Ectoin-Transport in H. elongata essentiell sind, konnte gezeigt werden, dass teaD die Aufnahme von Ectoin um die Hälfte reduziert (Grammann, 2004). Zu Beginn dieser Arbeit waren weder strukturelle noch biochemische Charakterisierungen für eines der Proteine des TeaABC Transporters oder TeaD vorhanden. Ziel dieser Arbeit war folglich die Charakterisierung des Transporters TeaABC und des USP TeaD auf struktureller und funktionaler Ebene. Die Untereinheiten des Transporters TeaABC und TeaD wurden in E. coli hergestellt und anschließend gereinigt. Das periplasmatische Bindeprotein TeaA und das cytoplasmatische USP TeaD erreichten beide hohe Expressionsausbeuten, die ausreichend für die 3D-Kristallisation waren. Das kleine Transmembranprotein TeaB und der Transporter TeaC konnten hingegen nur in mäßigen bis geringen Mengen hergestellt werden, die für strukturelle Untersuchungen nicht ausreichten. Für die Membranproteine konnten jedoch aufgrund von Topologievorhersagen Strukturmodelle erstellt werden. Insbesondere für den Transporter TeaC konnten zwei Tryptophane ermittelt werden, die vermutlich in der Ectoin Bindetasche liegen. Außerdem weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass TeaB nicht für den Transport wichtig ist, sondern vielmehr eine Chaperon-Funktion für die native und stabile Faltung von TeaC hat. Die Struktur von TeaA in Komplex mit Ectoin wurde durch SeMet-MAD bestimmt und einer Auflösung von 1,55 Å bestimmt während die Struktur von TeaA in Komplex mit Hydroxyectoin eine Auflösung von 1,8 Å hat. Die Kristallisation von TeaA ohne Ligand konnte nur unter Zugabe von Zn2+ zum Kristallisationstropfen erreicht werden. Die verfeinerte Apo-Struktur von TeaA hat eine Auflösung von 2,2 Å. TeaA besitzt zwei Domänen, von denen jede aus einem fünf- oder sechsfachen beta-Faltblatt besteht, die jeweils von fünf bzw. sechs alpha-Helices umgeben sind. Das Protein in Komplex mit Ligand hat eine geschlossene Konformation, während das Protein ohne Ligand eine offene Konformation aufweist. Durch Vergleich mit EhuB, einem Ectoin bindenden SBP eines ABC Transporters (Hanekop et al, 2007) konnten die Faktoren und Bindestellen im Protein ermittelt werden, die zu der sehr hohen Affinität von Ectoin und zu der geringeren Affnität von Hydroxyectoin führen. Funktionelle Studien von TeaA wurden mit Isothermaler Titrations Kalorimetrie (ITC) durchgeführt. Die Messungen zeigen, dass TeaA ein hoch affines Ectoin Bindeprotein ist (Kd = 0,19 (M), das eine schwächere, aber auch signifikante Affinität für Hydroxyectoin hat (Kd = 3,8 µM). TeaD besteht aus einem fünffachen parallelen beta-Faltblatt umgeben von fünf alpha-Helices. Die Struktur zeigt TeaD als ein Dimer von Dimeren, wobei an jedem Protein ein ATP Molekül mit einem Magnesium Atom gebunden ist. Die ATP Bindung von TeaD wurde untersucht und mit anderen ATP-bindenden Protein, wie bespielsweise ATPasen, verglichen. Die Untersuchung des Oligomerzustandes von TeaD (Schweikhard, 2008) hat gezeigt, dass ein tetramerer Komplex von TeaD in Abhängigkeit von ATP entsteht, während das Protein nur als Dimer vorliegt, wenn kein ATP zur Verfügung steht. TeaD könnte beispielsweise als Dimer in ATP limitierenden Bedingungen aktiv sein und den Ectoin-Import und -Efflux hemmen. Sobald jedoch ATP zur Verfügung steht, bildet TeaD inaktive Dimer-Dimer Komplexe. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit, konnte ein neues Modell für den Ectoin Haushalt in H. elongata aufgestellt werden.