Open Access

Alina Christin Madeleine Sittig

• Das schnelle und unkontrollierte Wachstum von Tumorzellen bedingt beim Glioblastom ein heterogenes Tumormikromilieu, mit lokalem Sauerstoff- und Nährstoffmangel. Lokaler Selektionsdruck bedingt eine Evolution besonders anpassungsfähiger Klone. Die integrierte Stressantwort (integrated stress response, ISR) ist ein zelluläres Programm, das durch zahlreiche Stressoren, wie endoplasmatische Retikulum Stress (ER-Stress), durch die Akkumulation ungefalteter Proteine, Hypoxie, Glukose- oder Aminosäuremangel aktiviert wird. Ein zentraler Schritt zur Aktivierung der ISR ist die Phosphorylierung der alpha Untereinheit des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2 (eIF2α) an Serin 51. Die Phosphorylierung von eIF2α führt zur Modulation der Translation mit Induktion des Transkriptionsfaktors ATF4 (Activating Transcription Factor 4), der dann zelluläre Anpassungsvorgänge einleitet. Unsere Hypothese lautete, dass ATF4-vermittelte molekulare Anpassungsmechanismen menschlicher Glioblastom (GB)-Zellen an die Bedingungen der Tumormikroumgebung (wie z.B. Hypoxie und Nährstoffentzug) maßgeblich zur Therapieresistenz beitragen und auch die Empfindlichkeit gegen TMZ-Chemotherapie beeinflussen. Somit könnte eine Inhibition der integrierten Stressantwort über den zentralen Mediator ATF4 zu einem gesteigerten Ansprechen auf Therapiebedingungen führen. Um die ISR und ATF4 als mögliche therapeutische Angriffspunkte im Glioblastom zu evaluieren, wurde die ATF4 Induktion in Glioblastomzellen pharmakologisch und genetisch moduliert und im Zusammenhang mit TMZ-Behandlung sowie Glukose- und Sauerstoffentzug untersucht. Unter Glutaminentzug, Hypoxie und TMZ-Behandlung, welche Aspekte der GB-Mikroumgebung widerspiegeln, zeigten sich erhöhte ATF4 Proteinspiegel. ATF4-gensupprimierte GB-Zellen (ATF4sh) exprimierten unter gleicher Behandlung wesentlich weniger ATF4. Im Einklang mit der Hypothese, dass ATF4 zur Therapieresistenz humaner Glioblastomzellen beiträgt, waren ATF4-gensupprimierte GB-Zellen (ATF4sh) im Vergleich zur Kontrollzelllinie empfindlicher gegen Hypoxie-induzierten Zelltod und zeigten einen erhöhten Sauerstoffverbrauch. Umgekehrt zeigten GB-Zellen nach pharmakologischer ISR Induktion einen verminderten Sauerstoffverbrauch. Auch nach Behandlung mit TMZ war die Überlebensrate in ATF4sh Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer. Zur Hemmung der ISR wurden verschiedenen Inhibitoren der Kinase PERK (Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase) entwickelt. In unseren Untersuchungen war nach der Behandlung der GB-Zelllinien eine verminderte ATF4 Expression festzustellen. Dabei kam es allerdings gleichzeitig bei der Behandlung mit höheren Inhibitorkonzentrationen zu einer Induktion von ATF4. Für den PERK-Inhibitor GSK 414 wurde in der Literatur auch die Hemmung anderer Kinasen wie KIT und RIPK1 gezeigt. Daher konnte bei den Konzentrationen, die für eine vollständige PERK-Inhibition erforderlich waren, keine selektive Hemmung von PERK mehr gewährleistet werden. Besonders aufgrund ihrer Toxizität auf die Funktion des Pankreas eignen sich diese Inhibitoren nicht für eine in vivo Erprobung. Da aber durch die Inhibition der ISR eine neuroprotektive Wirkung beschrieben ist, besteht die Notwendigkeit, weitere Inhibitoren zur Hemmung der ISR zu entwickeln. ISRIB (Integrated Stress Response Inhibitor) ist ein partieller ISR Inhibitor, der eIF2B angreift, was als Guanidin-Nukleotid-Austauschfaktor im Translationsinitiationsprozess benötigt wird. Für ISRIB wurde bereits in vitro und in vivo eine neuroprotektive, aber keine toxische Wirkung beschrieben. Zusammenfassend lieferten unsere Untersuchungen Hinweise auf die wichtige Rolle von ATF4 für die Anpassung humaner GB-Zellen an Bedingungen der Tumormikroumgebung und für die Entstehung von TMZ-Resistenzen. Die Hemmung der ISR in GB-Zellen könnte daher ein vielversprechender Therapieansatz sein.
• The rapid growth of glioblastoma cells results in a heterogeneous composition of the tumor microenvironment with local oxygen and nutrient deficiency. Local selection pressure triggers an evolution of particularly adaptive clones. The Integrated Stress Response (ISR) is a cellular adaptive program activated by numerous stressors such as endoplasmic reticulum stress through accumulation of unfolded proteins, hypoxia, glucose or amino acid starvation. A central step in activating the ISR is the phosphorylation of the alpha subunit of the eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2α) at serine 51. The phosphorylation of eIF2α leads to the modulation of translation with the induction of the transcription factor ATF4 (Activating Transcription Factor 4), which then initiates cellular adaptation processes. Our hypothesis was that ATF4-mediated molecular adaptation mechanisms of human glioblastoma (GB) cells to the condition of the tumor microenvironment (such as hypoxia and nutrient deprivation) contribute significantly to therapy resistance and also influence the sensitivity to temozolomide (TMZ) chemotherapy. Thus, inhibition of the integrated stress response via the central mediator ATF4 could lead to an improved response to therapy conditions. In order to evaluate ISR and ATF4 as possible therapeutic targets in glioblastoma, ATF4 induction in glioblastoma cells was modulated pharmacologically and genetically. Sensitivity to TMZ treatment and glucose and oxygen deprivation was analyzed. ATF4 was induced by glutamine deprivation, and hypoxia. Also, TMZ treatment resulted in ISR induction via ATF4. ATF4 expression was significantly reduced in ATF4 gene-suppressed GB (ATF4sh) cells. In line with the hypothesis that ATF4 contributes to therapy resistance of human glioblastoma cells, in ATF4 gene-suppressed GB cells (ATF4sh) sensitivity to hypoxia-induced cell death was increased. Additionally, ATFsh cells showed an increased oxygen consumption compared to the control cells and pharmacological ISR induction with tunicamycin led to reduced oxygen consumption. Treatment with TMZ led to reduced survival of ATF4sh cells compared to control cells. To inhibit ISR, various inhibitors of the kinase PERK (Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase) have already been developed. In our investigations, ATF4 expression was decreased by pharmacological PERK inhibition using the established compounds GSK 414 and AMG 44. At the same time however, treatment with higher inhibitor concentrations led to an induction of ATF4. For the PERK inhibitor GSK 414 an off-target inhibition of other kinases has previously been demonstrated in the higher concentration range. Therefore, it is plausible that concentrations required for a complete PERK inhibition in our cell models also influence other kinases. Especially because of the toxicity to the function of the pancreas, these inhibitors are not suitable for an in vivo evaluation. However, since a neuroprotective effect has been described by inhibiting the ISR, novel compounds for inhibiting the ISR need to be established. ISRIB (Integrated Stress Response Inhibitor) is a partial ISR inhibitor targeting eIF2B, which is required as a guanidine nucleotide exchange factor in the translation initiation process. A neuroprotective but no toxic effect has yet been described for ISRIB in vitro and in vivo. In summary, our experimental study provides evidence for an important role of ATF4 in the adaptation of human GB cells under conditions of the tumor microenvironment,such as low oxygen and nutrient availability, and in the development of TMZ resistance. Inhibition of ISR in GB cells could therefore be a promising therapeutic approach.