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Bao Ngoc Tran

• Redox homeostasis must be kept in balance for an intact redox signaling, which is necessary to control neuronal pathways such as growth cone pathfinding, synaptic plasticity and transmission (Oswald, Garnham, Sweeney, & Landgraf, 2018). Nucleoredoxin (NXN) is an oxidoreductase and thioredoxin-like protein holding two conserved cysteine residues in its structure (Funato & Miki, 2007), which are essential for its redox-regulating functionality. The function of NXN in neurons is still less well studied. But the expression of NXN in neurons, which was confirmed through analyzing adult NXN-LacZ reporter mice, suggested a dominant functional role in neuronal pathways. Initial experiments revealed calcium-calmodulin-dependent kinase 2 a (Camk2a) as a potential interaction partner through a Yeast-2-Hybrid screen (not shown) which is the major protein to induce synaptic plasticity during neuronal activity. Therefore, neuronal expression of NXN and the potential interaction with Camk2a prompted us to investigate deeper into the neuronal pathway. The goal of this work was to confirm the interaction of Camk2a and NXN with further experiments and to characterize behavior of mice carrying a neuronal NXN deletion. To achieve a pan-neuronal depletion of NXN expression in our mouse model, we used the Cre/loxP system with a NestinCre driver. We did not achieve the expected complete deletion of NXN due to unknown compensatory mechanisms. Nevertheless, the partial deletion of NXN in our transgenic mouse model prevented embryonic lethality as occurring in complete NXN knockout mice (Funato et al., 2010). The interaction of Camk2a and NXN was confirmed through proximity ligation assay (PLA) and immunofluorescence staining of primary cortical neurons. Investigations of the functional interaction revealed a lower redox-sensitivity of Camk2a activity in NXN-deficient brain samples. Additionally, the respiratory activity was significantly reduced in mitochondria of NXN deficient mouse brain pointing to possible dysfunctional mitochondria which is also observed in various neurodegenerative diseases, e.g.: Alzheimer, Parkinson, and Huntington disease (Norat et al., 2020). Unexpectedly, behavioral studies revealed only a subtle effect of the pan-neuronal NXN-deficiency. Significant differences between genotypes were found at the reduction of exploratory behavior and a reduced motivation for the voluntary wheel running in NesNXN-/- mice, which is normally seen as a joyful and rewarding activity. The observed behavior of NesNXN-/- mice potentially results from interaction mechanisms of NXN with Camk2a, as well as decreased oxidation of Camk2a and further unidentified target proteins of NXN. Conclusively, function of NXN was revealed as a non-essential redox modulator of Camk2a in neurons. The behavioral phenotype of NesNXN-/- mice is probably compensated through unknown mechanisms. Redox signaling of Camk2a in neurons is regulated through various components such as TXN or GSH, which can backup each other (Branco et al., 2017; Ren et al., 2017). NXN is an additional but not essential regulator.
• Oxidativer Stress wird mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer Demenz und Parkinson, aber auch mit neurologischen Entwicklungsstörungen wie Autismus-Spektrum-Störungen in Verbindung gebracht (Kandlur, Satyamoorthy, & Gangadharan, 2020; Matson & Williams, 2014). Eine Vielzahl an Erkrankungen kann durch das Ungleichgewicht der Redox-Homöostase verursacht werden. Hierbei sind ROS (reaktive Sauerstoffspezies) vermehrt vorhanden und können durch das Antioxidative System nicht mehr ausreichend reduziert werden (Eisner et al., 2018). Da im Gehirn die Speicherkapazität von Energie begrenzt ist (Peters et al., 2004), besteht ein kontinuierlicher Energiebedarf, der sowohl während der Aufrechterhaltung überlebenswichtiger Mechanismen als auch während hoher neuronaler Aktivitäten erzeugt wird (Hyder et al., 2013). ROS entsteht dabei als Nebenprodukt der mitochondrialen Zellatmung, welches eine Ansammlung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies) zur Folge haben kann. Befindet sich die ROS-Konzentration im physiologischen Bereich, können durch Oxidation der Signalproteine verschiedene Signalwege in den Neuronen aktiviert werden. Dazu gehören u.a. die Signalwege der axonalen Wegfindung, neuronale Netzwerkbildung und synaptische Plastizität (Oswald et al., 2018). Nucleoredoxin (NXN) ist ein Thioredoxin-ähnliches Protein, welches als Oxidoreduktase agiert (Urbainsky et al., 2018). Die genauen Funktionsmechanismen von NXN in den Neuronen sind bislang wenig untersucht. In der Proteinstruktur von NXN sind zwei konservierte Cysteine enthalten, die für die redoxregulierende Funktion wesentlich sind und somit Parallelen zum Thioredoxin aufweisen (Funato & Miki, 2007). Das Thioredoxin- und das Glutathion-System spielen als Reduktionssysteme von Disulfiden eine wesentliche Rolle in redox-modulierten Signalwegen (Drechsel & Patel, 2010; Holmgren, 2000). Mit dem Yeast-2-Hybrid-Screen identifizierten wir als potenziellen Interaktionspartner die Calcium-Calmodulin-abhängige Proteinkinase 2a (Camk2a). Camk2a spielt eine Hauptrolle im Signalweg der synaptischen Plastizität, die während neuronaler Aktivitäten stattfindet. Mit Hilfe von NXN-LacZ-Reportermäusen konnten wir eine Expression des NXN-Reporters in verschiedenen Arealen nachweisen, die für verschiedene Aspekte des Verhaltens von Bedeutung sind (Tran et al., 2021). Dies Färbungen zeigten eine Lokalisierung von NXN in Hirnregionen und im peripheren Nervensystem. Die neuronale Expression von NXN und die mögliche Interaktion mit Camk2a veranlassten uns daher, die Funktion von NXN in den Neuronen genauer zu untersuchen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Interaktion von Camk2a und NXN mit weiteren Experimenten zu bestätigen. Zusätzlich untersuchten wir die Auswirkungen des pan-neuronalen Mangels an NXN auf das Verhalten unserer transgenen Mäuse. Für unser Mausmodell generierten wir pan-neuronale NXN-knockout Mäuse. Dabei wurde das Cre/loxP-System verwendet, um mithilfe der Nestin gesteuerten Cre Rekombinase einen Neuronen-spezifischen Knockout zu generieren (NesNXN-/-). Der "knockout" war auf Protein-Ebene inkomplett und weist auf unbekannte Kompensationsmechanismen hin, verhinderte jedoch die embryonale bekannte fetale/embryonale Letalität, die bei vollständigen NXN-Knockout-Mäusen berichtet wurde (Funato et al., 2010). Demzufolge ermöglichte uns der partielle NXN-Knockout das Verhalten von adulten Mäusen zu untersuchen. Im Proximity Ligation Assay (PLA) wurden weniger Signalpunkte in den kortikalen Primärneuronen der NesNXN-/- detektiert als in den NXN-flfl Mäusen. Ein Signalpunkt im PLA entsteht, wenn sich die beiden Zielproteine in unmittelbarer Nachbarschaft befinden, um eine Rolling-Circle-Amplifizierung zu ermöglichen. Die Interaktion von Camk2a und NXN wurde durch den PLA weiter gestützt. Parallel zum PLA wiesen wir Camk2a und NXN durch Immunfluoreszenzfärbungen in den kortikalen Primärkulturen nach. Camk2a und NXN Signale wurden u.a. im Soma und in den dendritischen Dornen gefunden. Exzitatorische Neuronen des Kortex verbinden sich über dendritische Dornen mit weiteren exzitatorische Neuronen (Keller, 2002). Dendritische Dornen sind Fortsätze der Dendriten der exzitatorischen Neuronen. Sie sind in geringerem Umfang auch an inhibitorischen Neuronen zu finden (Keck et al., 2011). Sie spielen eine entscheidende Rolle in der neuronalen strukturellen Plastizität. Dabei ändert sich ihre Anzahl und Morphologie je nach der Funktionalität. Pilzförmige Dornen haben beispielsweise die längste Lebenszeit und kommen bei starken Neuronen Verknüpfungen vor (Frank et al., 2018). Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist eine Beschreibung der funktionellen Plastizität und beeinflusst die Morphologie und Dichte der dendritischen Dornen (Ciani et al., 2011; McLeod et al., 2018; Viale et al., 2019). Camk2a ist hierbei das Schlüsselenzym zur Generierung des LTP...