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Chemo-enzymatische Synthese lichtaktivierbarer RNA & Synthese lichtregulierbarer Oligonukleotide zur spektroskopischen Strukturaufklärung

  • Das wachsende Verständnis für das fein abgestimmte Zusammenspiel aus Struktur und Funktion von Nukleinsäuren resultiert aus unzähligen Forschungsprojekten. Forschende stehen dabei vor der Herausforderung, dass die zu untersuchenden Oligonukleotide sowohl modifiziert als auch in ausreichender Menge und Reinheit dargestellt werden müssen. Die chemische Festphasensynthese ist ein bewährtes Mittel zur Synthese hochmodifizierter DNA und RNA. Allerdings werden Oligonukleotide mit zunehmender Länge unzugänglicher, da die einzelnen Kupplungsreaktionen nicht quantitativ ablaufen, was zu schwer abtrennbaren Abbruchsequenzen führt. Hinzu kommt, dass während der chemischen Synthese harsche Reaktionsbedingungen nötig sind, denen die gewünschten Modifikationen standhalten müssen. (Chemo-) enzymatische Methoden können diese Hürden überwinden und somit den Zugang zu biologisch interessanten, längeren modifizierten Sequenzen ermöglichen. Jedoch erfolgt der enzymatische Einbau von Modifikationen ohne aufwendige Optimierung lediglich statistisch verteilt. Um weitere Erfolge im Bereich der Strukturaufklärung zu erzielen, werden somit Synthesemethoden benötigt, die sich zum positionsspezifischen Einbau von Modifikationen eignen und gleichzeitig den Zugang zu längeren Oligonukleotiden ermöglichen. Zur Untersuchung der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion haben sich in den letzten Jahren lichtadressierbare Verbindungen als gefragte Modifikationen erwiesen. Der Einsatz von Licht als mildes, nicht-invasives Auslösesignal stellt besonders im biologischen Kontext eine interessante Herangehensweise dar. Um hochwertige Aussagen über das Verhalten von Oligonukleotiden in komplexer biologischer Umgebung machen zu können, muss durch die gezielte Platzierung lichtaktivierbarer Verbindungen ein effizientes AN/AUS-Verhältnis geschaffen werden. Der Einbau photolabiler Schutzgruppen erlaubt eine vorübergehende Beeinflussung der Oligonukleotidstruktur, die durch Abspaltung der Schutzgruppe irreversibel (re-) aktiviert werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Einbau von Photoschaltern eine reversible Adressierbarkeit durch Isomerisierungsprozesse. Die Synthese komplexer gezielt-markierter Oligonukleotide erfolgt zumeist chemisch und ist daher längenlimitiert. Ziel dieser Doktorarbeit war es, beide Fragestellungen zu vereinen und eine chemo-enzymatische Methode zur RNA-Synthese zu untersuchen, die zum einen die positionsspezifische Modifizierung mit lichtaktivierbaren Einheiten erlaubt und darüber hinaus die Längenlimitierung der chemischen Festphasensynthese überkommt. Im Zentrum der Methode stehen drei enzymatische Reaktionsschritte zum Einbau von photolabil- und photoschaltbar-modifizierten Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphaten: I) eine 3‘-Verlängerung, in der die modifizierten Bisphosphate mit T4 RNA Ligase 1 mit dem 3‘-Ende einer RNA verknüpft werden; II) die Dephosphorylierung des 3‘-Phosphats mit Shrimp Alkaline Phophatase und III) die Verknüpfung der 3‘-terminal modifizierten RNA mit einem zweiten 5‘-phosphorylierten RNA-Fragment, wodurch eine Gesamtsequenz mit gezielt platzierter Modifikation entsteht (Abb. I). Im ersten Teilprojekt wurden in kollaborativer Arbeit zunächst benötigte photolabile NPE- und photoschaltbare Azobenzol-C-Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate synthetisiert und grundlegende Bedingungen der enzymatischen Reaktionen erarbeitet. Hierbei konnte der enzymatische Syntheseansatz erfolgreich in Lösung umgesetzt und der chemo-enzymatische Einbau aller synthetisierten Bausteine nachgewiesen werden. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wurde die Methode in eigenständigen Arbeiten weiterverfolgt, um den multiplen Einbau NPE-modifizierter Nukleosid-3‘,5‘-Bisphosphate in direkter Nachbarschaft sowie deren Einbau in DNA/RNA-Mixmere mit Phosphodiester- oder Phosphorthioatrückgrat zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die verwendeten Enzyme neben lichtaktivierbaren Modifikationen zusätzliche Anpassungen der Phosphateinheit sowie unterschiedliche Ribosebausteine in Kombination tolerieren. Da exogene RNA schnell von Exonukleasen abgebaut und somit unwirksam wird, werden zahlreiche stabilisierende Anpassungen an synthetischen RNAs vorgenommen. Zu den häufigsten zählen Phosphorthioate und Modifikationen der Ribose. Mit der erfolgreichen Modifikation der chimären Oligonukleotide eröffnet die erarbeitete Methode einen wichtigen Zugang zu therapeutisch interessanten Oligonukleotiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung biologisch relevanter Anwendungsmöglichkeiten konnte mit der Synthese, Charakterisierung und Umsetzung eines DEACM-geschützten Uridin-3‘,5‘-Bisphosphates (pUDEACMp) errungen werden. Im Vergleich zur verwendeten NPE-Schutzgruppe ist das Absorptionsspektrum der DEACM-Schutzgruppe bathochrom-verschoben, was eine Abspaltung mit Wellenlängen > 400 nm erlaubt. Dadurch können Zellschäden vermieden und Oligonukleotide mit NPE- und DEACM-Modifikation wellenlängenselektiv angesprochen werden...
  • The growing understanding of the precisely tuned interplay between the structure and function of nucleic acids is the result of countless research projects. Researchers are faced with the challenge that the oligonucleotides to be studied must be both modified and prepared in sufficient quantity and purity. Chemical solid-phase synthesis is a well-established technique for the synthesis of highly modified DNA and RNA. Unfortunately, oligonucleotides become more inaccessible with increasing length because the individual coupling reactions do not proceed quantitatively, resulting in truncated sequences that are difficult to separate. In addition, chemical synthesis requires harsh reaction conditions that the desired modifications have to withstand. (Chemo-) enzymatic methods can overcome these hurdles and thus provide access to biologically interesting, longer modified sequences. However, the enzymatic incorporation of modifications is only statistically distributed without extensive optimization. In order to achieve further success in the field of structure elucidation, synthesis methods are needed that are suitable for the position-specific incorporation of modifications and at the same time allow access to longer oligonucleotides. To study the relationships between structure and function, light-addressable compounds have emerged as popular modifications in recent years. The use of light as a mild, non-invasive trigger signal represents an interesting approach, especially in a biological context. In order to make high-quality statements about the behavior of oligonucleotides in complex biological environments, an efficient on/off ratio must be achieved through the selective placement of light-activatable compounds. The incorporation of photolabile protecting groups allows a temporary manipulation of the oligonucleotide structure, which can be irreversibly (re-)activated by cleavage of the protecting group. In contrast, the incorporation of photoswitches allows reversible addressability by isomerization processes. The synthesis of complex specifically labeled oligonucleotides is mostly done chemically and therefore length-limited. This dissertation aimed to combine both issues and to investigate a chemo-enzymatic method for RNA synthesis that, on the one hand, allows position-specific modification with light-activatable units and, on the other hand, overcomes the length limitation of chemical solid-phase synthesis. The method centers on three enzymatic reaction steps for the incorporation of photolabile- and photoswitchable-modified nucleoside 3',5'-bisphosphates: I) a 3'-extension in which the modified bisphosphates are linked to the 3'-end of an RNA with T4 RNA Ligase 1; II) dephosphorylation of the 3'-phosphate with Shrimp Alkaline Phosphatase; and III) linkage of the 3'-terminally modified RNA to a second 5'-phosphorylated RNA fragment, resulting in an overall sequence with specifically placed modification (Fig. I). In the first subproject, required photolabile NPE and photoswitchable azobenzene C-nucleoside 3',5'-bisphosphates were synthesized and basic conditions of the enzymatic reactions were elaborated in collaborative work. Here, the enzymatic synthesis approach was successfully realized in solution and the chemo-enzymatic incorporation of all synthesized building blocks was demonstrated. Based on these findings, the method was independently further investigated for the multiple incorporations of NPE-modified nucleoside 3',5'-bisphosphates in adjacent positions as well as for their incorporation into DNA/RNA mixmers with phosphodiester or phosphorothioate backbones. It could be shown that the enzymes used tolerate not only light-activatable modifications but also additional adaptations of the phosphate unit as well as different ribose building blocks in combination. Since exogenous RNA is rapidly degraded by exonucleases and thus becomes ineffective, numerous stabilizing adaptations are made to synthetic RNAs. Among the most common are phosphorothioates and modifications of ribose. With the successful modification of chimeric oligonucleotides, the developed method opens important access to therapeutically interesting oligonucleotides. Another important step toward biologically relevant applications could be achieved with the synthesis, characterization and conversion of a DEACM-protected uridine 3',5'-bisphosphate (pUDEACMp). Compared to the NPE protecting group used, the absorption spectrum of the DEACM protecting group is bathochromically shifted, allowing cleavage with wavelengths > 400 nm. This prevents cell damage and enables oligonucleotides with NPE and DEACM modification to be addressed in a wavelength-selective manner...

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Metadaten
Author:Anja BlümlerGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-696934
DOI:https://doi.org/10.21248/gups.69693
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Alexander HeckelORCiDGND, Harald SchwalbeORCiDGND
Advisor:Alexander Heckel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2022/09/10
Date of first Publication:2022/04/13
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2022/08/04
Release Date:2022/11/09
Page Number:218
Last Page:200
HeBIS-PPN:501390383
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht