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Alina Barbara Lehto

• To this day, stroke is the leading cause of death and disability worldwide. Due to increasing age of the world population and poor lifestyle, the incidence is further rising. Besides mechanical thrombectomy as a surgical option, there is a lack of therapeutic options with recombinant tissue plasminogen activator (rt-PA) being the only approved drug for treatment for ischemic stroke. However, there are various problems that make the administration of rt-PA difficult. In particular, it can only be given for ischemic (not hemorrhagic) stroke, and there is a narrow time frame of 4.5 hours after onset of stroke, in which it can be successfully applied. While the success rates of combined thrombectomy with rt-PA are around 60%, less than 5% of patients receive this therapy. ß-Hydroxybutyrate (BHB) is a ketone body that is formed in high amounts during fasting and lipolysis. Ketone bodes and the ketogenic diet have been shown to have neuroprotective properties in neurodegenerative diseases. In prior work of our group, the ketogenic diet was shown to have beneficial effects in mice after transient ischemia. In the present work, a single dose of BHB was tested for beneficial effects. For this purpose, microdialysis was used to demonstrate that BHB can cross the blood-brain barrier. For the next series of experiments, transient cerebral ischemia was induced in mice for 90 minutes by unilaterally occluding the middle cerebral artery (MCAO) with a silicone-covered filament. Behavioral tests one day after BHB administration showed that the moderate dose of 30 mg/kg, given immediately after reperfusion, improved the neurological score significantly whereas a lower (10 mg/kg) and a higher dose (100 mg/kg) had no effects The main part of the experiments focused on mitochondrial respiration as a potential mechanism of action for BHB. In isolated mitochondria from mouse brain, BHB (1-10 mM) was able to stimulate mitochondrial respiration stronger than pyruvate, but not as strong as succinate.. In the following experiments, MCAO was induced in vivo, and mitochondria were isolated and investigated ex vivo. Experiments were conducted 60 minutes, 24 hours, 72 hours, and 7 days after cerebral ischemia and reperfusion. Besides mitochondrial respiration (normalized to mitochondrial protein content or citrate synthase activity), several other parameters were monitored: the development of bodyweight throughout the experiment, citrate synthase activity, plasma metabolites and behavior to assess motor functions. Three behavioral tests were conducted: first, the Corner test, an experiment for measuring the extent of unilateral movement. Here, if a stroked mouse is put into a narrow corner (30°), it is most likely to turn unilaterally to the right, whereas an unimpaired mouse will turn to both sides randomly. From a total of 10 turns, a laterality index was calculated. Second, in the Chimney test, the mouse walks heads first into a tube. Once it reaches the end, the tube is tipped 90 degrees to stand on the table vertically. Motorically impaired animals have difficulties crawling backwards up to the top of the tube. The experiment was stopped if an animal did not reach the top of the tube within 60 seconds. Third, in the Rotarod test, the mouse is placed on a rotating beam on which it is supposed to walk for at least 60 seconds, and the time when the animal falls off the rotating tube is measured. All animals that had undergone ischemia showed massive weight loss until 72 hours after reperfusion. Weight loss then stagnated and there was a trend of increasing weight 7 days after reperfusion. The behavioral analysis showed that 24 hours after reperfusion, BHB-treated animals performed significantly better in the Corner test, meaning their moving patterns were more heterogeneous than those of saline-treated animals and in the Chimney test. 72 hours after reperfusion, BHB-treated animals still performed significantly better in the Chimney test, but 7 days after reperfusion, the performances of BHB- and saline-treated animals were no longer different from each other in any of the behavioral tests. In separate experiments, the plasma metabolites glucose, lactate, and pyruvate were changed in the animals that had undergone ischemia but were not affected by BHB administration. Mitochondrial respiration was tested at four time points after the administration of BHB after reperfusion – 60 minutes, 24 hours, 72 hours, and 7 days after transient cerebral ischemia. 60 minutes later, data showed an increase of oxygen consumption of the complexes I and II. OxPhos was also increased but the effect at this point, did not reach statistical significance. 24 hours after reperfusion, this effect was consolidated: complex I, complex II and OxPhos respiration were significantly improved in the BHB-treated group compared to saline...
• Der Schlaganfall ist eine der weltweit häufigsten Todesursachen – aufgrund des steigenden Alters der Weltbevölkerung, stieg die Inzidenz in den letzten Jahrzehnten. Ein Schlaganfall kann hämorrhagischer oder ischämischer Natur sein. Der hämorrhagische Schlaganfall tritt seltener auf, führt allerdings in bis zu 80% der Fälle zum Tod des Patienten. Der ischämische Schlaganfall hingegen tritt seltener auf, betrifft häufig ältere Menschen und ist eine häufige Ursache für Behinderung und eingeschränkte Lebensqualität. Behinderungen als Folge eines Schlaganfalls schließen unter anderem kognitive und motorische Einschränkungen, Blaseninkontinenz und Depressionen ein. Trotz intensiver Forschung in den vergangenen Jahrzehnten gibt es bis heute neben der endovaskulären Thrombektomie, einem mechanischen Verfahren zur Entfernung des Thrombus, nur eine zugelassene pharmakologische Intervention zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls, nämlich den rekombinanten gewebsspezifischen Plasminogenaktivator (rt-PA). Beide Therapieoptionen verfügen über ein geringes Zeitfenster von unter 4,5 Stunden und bedürfen einer strengen Indikationsstellung, da bei fälschlicher Anwendung Komplikationen, beispielsweise Gefäßrupturen, systemische oder subarachnoidale Blutungen drohen. Weitere Interventionsmöglichkeiten, die in der Vergangenheit erforscht wurden, wiesen die Problematik auf, dass sie in Tiermodellen funktionierten, aber im Menschen nicht die gewünschten Effekte zeigten. Dies kann zum einen daran liegen, dass sich Tiermodelle nicht 1:1 auf den Menschen übertragen lassen. Zum anderen kann es daran liegen, dass viele der erforschten Substanzen als Neuroprotektiva in einem kleinstmöglichen Zeitfenster gegeben werden müssen; im Experiment werden sie oft vor der Auslösung des Schlaganfalls verabreicht. Das ist in der klinischen Situation aufgrund der strengen Indikationsstellung des Schlaganfalls häufig nicht möglich. Es bedarf also dringend einer untoxischen pharmakologischen Intervention, die unabhängig von der Art des Schlaganfalls, beispielsweise bereits im Krankenwagen auf dem Weg ins Krankenhaus verabreicht werden kann. Ein Ansatz, der bereits von diesem Arbeitskreis verfolgt wurde und in Mäusen vielversprechende Ergebnisse gezeigt hat, ist die ketogene Diät. Ketonkörper stellen im z.B. Fastenzustand, bei kohlenhydratarmer Diät, oder bei langer und intensiver körperlicher Betätigung eine Quelle für Acetyl-CoA dar. Sie dienen als alternative Energiequelle für das Gehirn. Die drei Ketonkörper, die endogen von der Leber gebildet werden, sind Acetoacetat, Aceton und ß- Hydroxybutyrat (BHB). In vorangegangenen Experimenten dieses Arbeitskreises wurden Mäuse fettreich und kohlenhydratarm ernährt, sodass sie eine Ketose entwickelten. Im Vergleich zu normal ernährten Tieren schnitten ketogen ernährte Mäuse nach 90-minütiger transienter Ischämie in Verhaltensversuchen, die 24 Stunden nach Reperfusion durchgeführt wurden, besser ab als die normal ernährten Tiere. Da eine durch ketogene Diät hervorgerufene Ketose ebenfalls keiner klinischen Situation entspricht, die kurzfristig herbeigeführt werden kann, ist ein praktikablerer Ansatz die Verabreichung des Ketonkörpers BHB unmittelbar nach Reperfusion nach 90-minütiger transienter Ischämie. Obwohl BHB bereits im Schlaganfall und anderen neurodegenerativen Erkrankungen untersucht wurde, ist sein Wirkmechanismus bis heute weitgehend unbekannt. Es gibt Hinweise darauf, dass BHB einen positiven Einfluss auf die mitochondriale Atmung hat. Außerdem gilt es als nachgewiesen, dass BHB die Blut-Hirn-Schranke mittels Monocarboxylat-Transporter überwindet. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst untersucht, ob BHB als einmalige Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht die Blut-Hirn-Schranke überwindet, wie lange es im Extrazellularraum nachweisbar ist, und ob die Verabreichung einer einmaligen Dosis metabolische Veränderungen im Striatum zur Folge hat. Die BHB Konzentrationen im Striatum stiegen nach intraperitonealer Injektion innerhalb der ersten 30 Minuten etwa auf den doppelten Wert (von 2 auf 4 μM). Die Stoffwechselmetabolite Glukose, Laktat und Pyruvat waren nach BHB-Gabe unbeeinflusst...