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Melinda Brunstein

• Mitochondrial RNA granules (MRGs) are membraneless, highly specialized compartments that play an essential role in the post-transcriptional regulation of mitochondrial gene expression. This regulation is crucial for maintaining energy production, controlling metabolic functions and ensuring homeostasis in cells. Dysregulation of mitochondrial genes has been linked to various human diseases, including neurodegenerative and metabolic disorders as well as certain types of cancer. MRGs are composed of different RNA species, including mitochondrial precursor RNA (pre-RNA), mature tRNAs, rRNAs and mRNAs complexed with multiple proteins involved in RNA processing and mitoribosome assembly. However, despite the significance of MRGs, their protein composition, structural organization, stability and dynamics during stress conditions remain elusive. In the study reported here, I adopted a three-step approach to address the aforementioned fundamental issues. First and foremost, I identified the protein composition of MRGs and unveiled their architectural complexity. To characterize the MRG proteome, I applied the cutting-edge TurboID-based proximity labeling approach combined with quantitative mass spectrometry. Proximity labeling was conducted on 20 distinct MRG-associated human proteins, resulting in the identification of more than 1,700 protein-protein interactions. This expansive dataset enabled me to create a comprehensive network, providing valuable insights into both the (sub)architecture as well as the core structure of MRGs in-depth. Secondly, I investigated the spatio-temporal dynamics of MRGs under various mitochondrial stress conditions. To monitor the morphological alterations and compositional changes of MRGs, I utilized time-resolved confocal fluorescence microscopy and proteomics, respectively. In this analysis, I applied IMT1, the first specific inhibitor that selectively targets mitochondrial transcription. Using this methodology, I pinpointed precise conditions that triggered MRGs’ disassembly during stress, followed by their reassembly when nascent RNA production was restored. The results of this examination elucidate that MRGs are highly dynamic and stress adaptive structures, capable of rapid dissolution and reassembly, a process closely connected to mitochondrial transcription. Thirdly, I aimed to explore the impact of RNA turnover on MRGs’ integrity during stress, employing confocal fluorescence microscopy and quantitative real-time PCR. I observed that depletion of MRG proteins associated with RNA degradation counteracts MRGs’ disassembly under stress conditions, a phenomenon attributed to the accumulation of double-stranded RNA (dsRNA). These results emphasize the critical role of pre-RNA turnover in maintaining MRG integrity and reveal that MRGs can be stabilized by dsRNA. Taken together, the comprehensive investigation reported in this thesis has substantially broadened and deepened our understanding of MRGs’ complexity. By identifying their molecular structure and dynamics, I have gained significant insights into the fundamental characteristics and biological functions of MRGs in cellular processes. This knowledge contributes to the identification of disease-related pathways linked to mitochondrial gene expression and may inspire future studies to develop novel therapeutic approaches.
• Mitochondriale RNA Granulate (MRGs) sind membranlose, hochspezialisierte Kompartimente, die eine wesentlich Rolle bei der post-transkriptionellen Regulierung der mitochondrialen Genexpression spielen. Diese Regulierung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Energieproduktion, die Kontrolle der Stoffwechselfunktionen und die Gewährleistung der Homöostase in Zellen. Eine Fehlregulation mitochondrialer Gene wird in Verbindung mit verschiedenen menschlichen Krankheiten gebracht, darunter neurodegenerative und metabolische Störungen sowie bestimmte Krebsarten. MRGs bestehen aus verschiedenen Arten von RNA, einschließlich mitochondrialer Vorläufer-RNA (prä-RNA), reifer tRNAs, rRNAs und mRNAs, die mit zahlreichen Proteinen verbunden sind, die an der RNA-Verarbeitung und dem Zusammenbau der Mitoribosomen beteiligt sind. Obwohl MRGs von großer Bedeutung sind, bleibt ihre Proteinzusammensetzung, strukturelle Organisation, Stabilität und Dynamiken unter Stressbedingungen nach wie vor unbekannt. In der hier vorgestellten Studie habe ich einen dreistufigen Ansatz gewählt, um die oben genannten grundlegenden Fragen zu klären. Zuallererst habe ich die Proteinzusammensetzung der MRGs identifiziert und ihre architektonische Komplexität aufgeklärt. Zur Charakterisierung des MRG-Proteoms wendete ich den fortschrittlichen TurboID-basierten proximity-labeling-Ansatz in Kombination mit quantitativer Massenspektrometrie an. Ich führte dieses proximity labeling an 20 verschiedenen MRG-assoziierten menschlichen Proteinen durch und identifizierte dabei mehr als 1.700 Protein-Protein-Interaktionen. Dieser umfangreiche Datensatz ermöglichte mir die Erstellung eines umfassenden Netzwerkes, das wertvolle Einblicke sowohl in die (Teil-)Architektur als auch in die Kernstruktur der MRGs in großer Tiefe bietet. Zweitens untersuchte ich die raumzeitlichen Dynamiken der MRGs unter verschiedenen mitochondrialen Stressbedingungen. Um sowohl die morphologischen Veränderungen als auch die Veränderungen in der Zusammensetzung der MRGs zu beobachten, nutzte ich zeitaufgelöste konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Proteomik. Für diese Analysen setzte ich IMT1, den ersten spezifischen Inhibitor für die mitochondriale Transkription ein. Mithilfe dieser Methodik konnte ich die genauen Bedingungen ermittelt, unter denen sich MRGs während Stress auflösen und nach Wiederherstellung der RNA Transkription erneut zusammensetzen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung verdeutlichen, dass es sich bei den MRGs um hochdynamische und stressangepasste Strukturen handelt, die in der Lage sind, sich schnell aufzulösen und wieder zusammensetzen, ein Vorgang der eng mit der mitochondrialen Transkription verbunden ist. Drittens hatte ich das Ziel, die Auswirkungen des RNA-Umsatzes auf die Integrität der MRGs unter Stressbedingungen mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie und quantitativer Echtzeit-PCR zu untersuchen. Dabei beobachtete ich, dass die Depletion von MRG-Proteinen, die mit dem RNA-Abbau verbunden sind, der Auflösung von MRGs unter Stressbedingungen entgegenwirkt. Dieses Phänomen ging mit einer Anhäufung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) einher. Die Ergebnisse unterstreichen die kritische Rolle des prä-RNA-Umsatzes für die Aufrechterhaltung der MRG-Integrität und zeigen, dass MRGs durch dsRNA stabilisiert werden können. Insgesamt hat die umfassende Untersuchung, die im Rahmen dieser Dissertationsschrift berichtet wird, unser Verständnis für die Komplexität von MRGs erheblich erweitert und vertieft. Durch die Identifizierung ihrer molekularen Struktur und Dynamiken habe ich bedeutende Einblicke in die grundlegenden Eigenschaften und biologischen Funktionen der MRGs in zellulären Prozessen gewonnen. Dieses Wissen trägt zur Identifizierung von krankheitsbezogenen Signalwegen bei, die mit der mitochondrialen Genexpression verbunden sind und kann künftige Studien zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze inspirieren.