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Roland Weiß

• Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von Rinder­Adrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe­2S]­Eisen­Schwefel­ Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N­ oder 15 N, 13 C­angereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMR­Experimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMR­aktiven Kerne konnten durch 15 N­ und 13 C­editierte dreidimensionale NOESY­Experimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR­ aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des Eisen­Schwefel­Clusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 ­Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct­( 15 N, 1 H)­HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des Eisen­Schwefel­Cluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der Eisen­Schwefel­Cluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen­ Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA ­ Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der Eisen­Schwefel­Cluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des Eisen­Schwefel­Cluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder­ Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 ­Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran­ Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 ­Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des Eisen­Schwefel­Cluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C­ Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das C­terminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem C­Terminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. Rinder­Adrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)­Protein welches 22% beta­Faltblatt, 17% alpha­Helix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 beta­Faltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 beta­Faltblätter auf die Aminosäurereste 8­12, 18­22, 57­59, 88­89 und 103­106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 6­12, 21­24, 57­58, 88­89 und 103­106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 29­35, 64­66, 72­29 und 98­100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 33­36, 61­64, 72­75 und 98­100 charakterisiert. Der Eisen­Schwefel­Cluster ist kovalent an die vier Cystein­Reste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSD­Wert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von Rinder­Adrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.