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Jan-Peter Koch

• In der vorliegenden Arbeit wurde ein durch Zellschrumpfung aktivierter nichtselektiver Kationenkanal, der in der M­1 Sammelrohrzellinie der Maus bereits früher beobachtet worden war [Volk et al., 1995], hinsichtlich seiner Selektivität, seines Inhibitorspektrums und seines Aktivierungsmechanismus mittels der Patch Clamp­Technik näher charakterisiert, und es wurde geprüft, ob dieser oder ein ähnlicher Kanal auch von anderen Zellinien exprimiert wird, wobei außer epithelialen Zellinien (HT 29 , BSC­1) auch solche aus Muskel­ (A10) und Ner­ vengewebe (Neuro­2a) untersucht wurden. Zellschrumpfung in symmetrischer NaCl­Lösung mit Zusatz von 100 mM Saccharose im Bad stimulierte einen von Kationen getragenen Einwärtsstrom. Während der initialen Phase der Aktivierung durch extrazelluläre Hyperosmolarität konnten Schaltvorgänge von Einzelka­ nälen beobachtet werden. Die Einzelkanalleitfähigkeit in den verschiedenen Zellinien betrug 15 bis 27 pS. Der Strom stieg nach wenigen Minuten um das 30­ bis 60fache an. Austausch des extrazellulären Natriums durch das schlecht permeierende NMDG führte zum kompletten Sistieren des Einwärtsstroms. Die Aktivierung des nichtselektiven Kationenstroms war unab­ hängig von der absoluten Osmolarität der Badlösung. Sie wurde ausschließlich durch osmo­ tisch bedingte Volumenabnahme (Schrumpfung) der Zellen hervorgerufen, wobei die Zell­ schrumpfung der Aktivierung des Stroms geringgradig vorauseilte. Die Aktivierung durch Zellschrumpfung war reversibel und konnte mit dem gleichen Zeitverlauf und mit der glei­ chen Leitfähigkeitszunahme auch zweimal hintereinander ausgelöst werden. Die stimulierte Kationenleitfähigkeit war hochselektiv für Kationen über Anionen, aber nichtselektiv für die monovalenten Kationen NH 4 , Natrium, Kalium und Lithium (Leitfähig­ keitssequenz NH 4 > Na > K > Li ). Für divalente Kationen wie Kalzium und Barium war keine Leitfähigkeit meßbar. Flufenaminsäure (100 µM) hemmte den stimulierten Einwärts­ strom um mehr als 80 %, Diphenylamin­2­Carboxylsäure (DPC) und sein Derivat Dichlor­ DPC (DCDPC) hatten einen etwas geringeren Hemmeffekt. Noch schwächer hemmte LOE 908. Amilorid, Quecksilber und Bumetanid hatten praktisch keine Hemmwirkung auf den stimulierten Einwärtsstrom. Maitotoxin, ein Aktivator mancher nichtselektiver Kationenka­ näle, hatte unter isoomotischen Bedingungen keine stimulatorische Wirkung auf den Strom. Im Gegensatz zum Ca 2 ­aktivierten nichtselektiven Kationenkanal, der in exzidierten Membranflecken beobachtet wird, war die Aktivierung des schrumpfungsinduzierten nicht­ selektiven Kationenkanals unabhängig von der zytoplasmatischen Ca 2 ­Konzentration. Das Ausmaß der Stimulation war allerdings vermindert, wenn die Pipettenlösung hohe Konzen­ trationen von Kalziumchelatoren (10 mM EGTA oder 10 mM BAPTA) enthielt. Dagegen hemmte Magnesiumentzug die Antwort auf Zellschrumpfung fast vollständig. ATP in Kon­ zentrationen bis 10 mM in der Pipettenlösung konnte die Aktivierung des Einwärtsstroms nicht verhindern, nur reduzieren. Dagegen unterdrückte ATP­Verarmung der Zellen (durch Inkubation mit Rotenon und 2­Deoxyglukose) die Antwort auf Zellschrumpfung völlig. Auch durch Zusatz von 1 mM ATP zur Pipettenlösung konnte die Antwort in ATP­verarmten Zel­ len nicht wiedergewonnen werden, obwohl die Zellen nach Auswaschen der Stoffwechsel­ gifte wieder normal reagierten. Die Proteinkinasehemmstoffe Staurosporin und Calphostin C (beide in der Konzentration von 1 µM) konnten die Antwort unterdrücken. Einige auf das Zytoskelett wirksame Substanzen (Cytochalasin D und Taxol) hatten ebenfalls hemmende Wirkungen. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, daß der schrumpfungsaktivierte nichtselekti­ ve Kationenkanal offenbar ubiquitär exprimiert wird. Der Aktivierungsmechanismus ist kom­ plex und abhängig von intrazellulärem ATP und Magnesium. Vermutlich sind Proteinkinasen und Zytoskelettelemente an der Kanalaktivierung beteiligt. Der Kanal dürfte im Rahmen der Zellvolumenregulation von Bedeutung sein und spielt möglicherweise eine Rolle für Zellpro­ liferation und Apoptose.