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Christian Gorba

• Results were presented from Brownian dynamics simulations for cyt c molecules approximated as spherical particles with diameter 2R ' 3.3 nm interacting with a charged planar membrane surface. Using the well-known Ermak-McCammon algorithm of ref. [36, 37] for solving the Langevin equations (see Chapter 2), a new computer program in C++ was developed. An overview of the way it is implemented is given in Chapter 3. The program in its current state is able to compute the trajectories (translation and rotation) of hundreds of spherical particles in systems with typical dimensions of 103 − 1003 nm3 . As explained in the introductory Chapter 1 the motivation for studying the dynamics of cyt c molecules in such systems came from the progress in the research of photosynthetic bacteria, e.g. While the internal processes of energy transduction (light harvesting, channelling to RC, charge separation) are quite well understood, the dynamics of soluble cyt c as an electron transporter in this context is not yet clear. In many textbooks one can find illustrations where a single cyt c is responsible for the electron transport between two integral membrane proteins (the reaction centre RC and the bc1 complex). But as pointed out in publications like refs. [49], [59], [60], [61] or [62] biological cells are crowded with different molecules. Consequently, one can assume that the electron transport between two integral membrane proteins is not simply taken on by one single cyt c molecule. Instead it is likely that many of these particles are located in a cyt c pool above the membrane and that they perform the electron transport in turns. Thus, it is desirable to have a simulation package that is able to compute the trajectories of many proteins. Note that the detailed processes of electron transfer and binding to membrane proteins are not modelled here. The details of these processes are quite complicated so that we refrained from including them in the coarse-grained simulations. Here, the actual binding is simply defined by a particle distance zb from the membrane which marks the beginning of the attractive potential. ...
• Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Brownschen Dynamik von Proteinen in der Nähe einer homogen geladenen ebenen Membran. Letztere kann neben der homogenen Ladung auch noch an beliebigen Stellen Ladungs- und van der Waals-Domänen enthalten. Die Dynamik der Teilchen wird hier mit Hilfe von Computersimulationen untersucht. Beispiele für solche Phänomene finden sich in der Natur in großer Zahl. Die Photosynthese, in der Sauerstoff aus Kohlendioxid erzeugt wird, war Hauptmotivation für die vorliegende Arbeit. Sie ist einer der wichtigsten Naturvorgänge in bezug auf die Entstehung von Leben auf der Erde. Die Umgebung, in der die photosynthetischen Vorgänge ablaufen, entspricht im wesentlichen dem oben beschriebenen System aus diffundierenden Teilchen und geladener Membran. Diese geladene Wand wäre somit z.B. die Lipidmembran des Teils eines Bakteriums, der für die Photosynthese zuständig ist, die Ladungs- und van der Waals-Domänen entsprächen beispielsweise den Membranproteinenkomplexen, wie den lichtabsorbierenden Komplexen (Light Harvesting Complexes, kurz LHC), dem Reaktionszentrum, sowie dem sogenannten Cytochrom bc1-Komplex. Die Brownschen Teilchen schließlich stellten jene Moleküle (Cytochrom c Proteine, kurz cyt c) dar, welche den bei der Photosynthese notwendigen Elektronentransfer vom bc1-Komplex zum Reaktionszentrum (Reaction Center, kurz RC) übernehmen. Die internen Vorgänge der Photosynthese wie Lichtabsorption, Ladungstrennung usw. sind hier nicht Gegenstand der Untersuchung, sondern einzig die Dynamik der cyt c Moleküle oberhalb der Lipidmembran und deren Annäherung an das RC und den bc1-Komplex (Elektronenabgabe bzw. -aufnahme). In bisherigen Untersuchungen wurde eine solche Assoziation nur jeweils paarweise studiert, d.h. mit einem diffundierenden Protein und z.B. einem bc1-Komplex. Im sogenannten Periplasma über der Membran gibt es allerdings eine Vielzahl von Molekülen, die sich entsprechend gegenseitig beeinflussen. Es handelt sich also um Mehr-Teilchen-Systeme. Daher wird in dieser Arbeit eine Vielzahl (max. O(100)) von diffundierenden cyt c betrachtet. Neu an diesem Ansatz ist also die Berücksichtigung der Möglichkeit, daß nicht nur ein einzelnes cyt c nahe der Membranproteine lediglich zwischen RC und bc1-Komplex hin- und herdiffundiert, sondern auch zurück in Lösung gehen kann. Dort kann es dann mit weiteren cyt c Molekülen wechselwirken, und schließlich kann ein anderes cyt c an die Membranoberfläche gelangen und dort den Elektronentransfer bewerkstelligen. Dies hat vermutlich einen großen Einfluß auf die Häufigkeit der Elektronentransfers. Da es bisher kein in der Literatur bekanntes Software-Werkzeug gibt, das Simulationen, wie sie in dieser Arbeit beschrieben werden, erlaubt, musste zunächst ein geeignetes Programm entworfen und entwickelt werden. Hierzu wurde C++ benutzt, weil diese Sprache einerseits schnell ist und andererseits objektorientiertes Programmieren erlaubt, wodurch der Source Code leichter zu warten und erweiterbar wird. Um den Rechenaufwand bewältigen zu können, war eine vereinfachende Systemmodellierung notwendig. Daher werden die cyt c Moleküle in dieser Arbeit als sphärische Teilchen mit einem Monopol- und einem Dipolmoment beschrieben. Die Bewegung der Teilchen wird mittels Brownscher Dynamik berechnet. D.h., erstens werden Zeitskalen betrachtet, auf denen sich die Teilchen im thermischen (Geschwindigkeits-) Gleichgewicht mit dem Solvens befinden, und zweitens wird der Solvens selbst nicht explizit modelliert. Die Membran wird als starre, geladene Oberfläche beschrieben, und Membranproteine können als geladene van der Waals-Kugeln in die Oberfläche eingebettet werden. Damit schließt sich sozusagen der Kreis zum einleitenden Satz: es wurde ein Programm zur Untersuchung der Brownschen Dynamik von Proteinen in der Nähe einer homogen geladenen ebenen Wand entwickelt. Dieses recht allgemeine Modellsystem kann auf verschiedene biologische Systeme angewandt werden, wobei es in der vorliegenden Arbeit ausschließlich um eine Beschreibung der Gleichgewichtsdynamik von cyt c über einer Membran geht. Bevor im letzten Kapitel Ergebnisse von Rechnungen inklusive Membranproteinen beschrieben werden, liegt das Hauptaugenmerk auf der Untersuchung von Konzentrationsprofilen in der Simulationsbox mit strukturloser, geladener Membran. Damit ist die Verteilung der Modellproteine im Simulationsvolumen oberhalb der Membran gemeint. Diese Proteinverteilung ist naturgemäß stark abhängig von der Art der Wechselwirkungen sowohl der Teilchen untereinander als auch von der Art der Wechselwirkungen mit der Wand. Es werden elektrostatische und van der Waals Wechselwirkungen zwischen den Brownschen Partikeln, sowie ebenso elektrostatische und van der Waals Kräfte zwischen Brownschen Teilchen und Membran berücksichtigt. Im folgenden wird auf die wichtigsten Teile der einzelnen Kapitel näher eingegangen. Im Einführungskapitel 1 werden zunächst grundsätzliche Bemerkungen über das Wechselspiel zwischen Theorie, Experiment und Computersimulation gemacht. Die Simulation ist demnach eine nützliche Schnittstelle zwischen den anderen beiden "Disziplinen". Im Anschluß daran wird in Abschnitt 1.1 erklärt, was mit Brownscher Bewegung gemeint ist und welche immense Bedeutung sie für viele Prozesse in biologischen Zellen hat. Weiter geht es mit kurzen Beschreibungen der wichtigsten zwei "Referenzsysteme" für die vorliegende Arbeit in den Abschnitten 1.2 und 1.3. Neben der schon mehrfach erwähnten Photosynthese gehört auch die Atmungskette dazu. Der darauffolgende Abschnitt 1.4 beschreibt das in allen Simulationen als Brownsches Teilchen benutzte Protein cyt c. Eine bekannte 3D-Kristallstruktur (stellvertretend aus Pferdeherz) wird dargestellt und gezeigt, daß die Ladungsverteilung tatsächlich gut durch einen Monopol- und einen Dipolterm beschrieben werden kann. Es folgt mit den Abschnitten 1.5 und 1.6 eine Einführung in den Aufbau biologischer Membranen, und es werden wichtige Experimente zur Bindung von cyt c an Membranen vorgestellt. Danach werden in Abschnitt 1.7 zwei wichtige Simulationstechniken gegenübergestellt. Dies sind die Moleküldynamik und die Brownsche Dynamik. Warum, wie schon zuvor gesagt, letztere in dieser Arbeit benutzt wird, wird dort ausführlicher erläutert. Im Kapitel 2 werden die (mathematischen) Methoden zur Beschreibung der zu simulierenden Systeme und die Behandlung der Randbedingungen erläutert. Die Brownsche Dynamik und ihre statistische Natur wird ausführlich in Abschnitt 2.1 erklärt. In Unterabschnitt 2.1.2 findet man die Bewegungsgleichungen (Langevin Gleichungen) sowie deren Lösung. Die Wechselwirkungsterme, die in die Bewegungsgleichungen einfließen, werden im Abschnitt 2.2 hergeleitet (siehe auch: C. Gorba and V. Helms. Diffusional dynamics of cytochrome c molecules in the presence of a charged surface. Soft Materials, 1:187, 2003). Dazu gehört die hydrodynamische Wechselwirkung, welche durch den Solvens vermittelt wird und durch Matrizen beschrieben werden kann (Unterabschnitt 2.2.1). Ferner gibt es die durch Ladungen hervorgerufenen elektrostatischen Kräfte (Unterabschnitt 2.2.2) und die bei geringen Abständen dominierenden van der Waals Kräfte. Letztere sind quantenmechanischer Natur und werden hier durch empirische Potentiale beschrieben (Unterabschnitt 2.2.3). Eine Beschreibung des Simulationssystems und der Randbedingungen findet man im Abschnitt 2.3. Benutzt werden sowohl eine Kombination aus reflektierenden und 2-dimensionalen periodischen Randbedingungen (Unterabschnitt 2.3.2), als auch eine Kombination aus reflektierenden Rändern und einer offenen Wand (Unterabschnitt 2.3.3). Durch diese können Brownsche Teilchen in die Simulationsbox herein- oder aus ihr heraus fließen. Diese als Schnittstelle zwischen Simulationsbox und Gebieten mit freier Diffusion fungierende offene Wand wird mittels eines neuentwickelten Einfügungsalgorithmus realisiert (siehe auch: T. Geyer, C. Gorba and V. Helms. Interfacing Brownian dynamics simulations. J. Chem. Phys., 120:4573, 2004). Das Kapitel 3 beschreibt Details des entwickelten Computerprogramms. Es werden die entwickelten Klassen, welche die Eigenschaften und Funktionalitäten der verschiedenen Teilobjekte des Simulationssystems, wie z.B. des Objektes "Protein", modellieren, vorgestellt. Außerdem findet man eine Analyse der Programmperformance, d.h. Aussagen darüber, welche Teilberechnungen während einer Simulation wieviel CPU-Zeit verbrauchen. Danach geht es schließlich zu den einzelnen Simulationen und deren Ergebnissen. Als erstes behandelt Kapitel 4 Simulationen mit geschlossener Wand oberhalb der Membran. D.h., Teilchen können die Simulationsbox weder verlassen, noch können neue Teilchen hinzukommen. Diese Form der Randbedingungen war im Laufe des Projektes als erstes verfügbar und dienten im wesentlichen als Test für verschiedene Szenarien. Im Abschnitt 4.1 wird ein einfacher Test des Source Codes vorgestellt, mit dem geprüft wird, ob der Algorithmus zur Lösung der Langevin Gleichungen richtig implementiert wurde. Dabei handelt es sich um die freie Brownsche Bewegung zweier Teilchen. Es folgt die Auswertung einiger Rechnungen mit und ohne hydrodynamische Wechselwirkung in Abschnitt 4.2. Es werden hier Diffusionskoeffizienten und Konzentrationsprofile ermittelt. Der Vergleich liefert Aussagen über den Einfluß der verwendeten Standardhydrodynamik. Der nächste Abschnitt 4.3 befasst sich mit dem Phänomen des "molecular crowding". Biologische Zellen sind in der Regel sehr stark von allen möglichen Molekülen bevölkert. Man sollte daher erwarten, daß es häufig einen indirekten Einfluß von nicht direkt an den betrachteten Prozessen beteiligten Teilchen gibt. Dem wird hier in einem vorsichtigen ersten Schritt dadurch Rechnung getragen, daß zusätzliche Brownsche Teilchen in die Box gepackt werden, die ungeladen sind und somit nicht an der elektrostatischen Wechselwirkung mit der Membran teilnehmen. Allein durch ihre Teilnahme an der hydrodynamischen und an den van der Waals Wechselwirkungen verändern sie das Diffusionsverhalten der hier interessierenden cyt c Moleküle und deren Verteilung oberhalb der Membran. Kapitel 5 basiert auf den Ausführungen in "C. Gorba, T. Geyer and V. Helms. Brownian dynamics simulations of simplified cytochrome c molecules in the presence of a charged suriv face. J. Chem. Phys., 121:457". Dort werden nun mit Hilfe des weiter oben schon erwähnten Einfügungsalgorithmus Teilchenfluktuationen zugelassen. Auf diese Weise ist es möglich, den interessierenden Bereich nahe der Wand von einem Bereich freier Diffusion (bulk) zu entkoppeln und damit u.a. Rechenzeit zu sparen. Mit Simulationen, die dieses neue Verfahren benutzen, ist es gelungen, experimentelle Ergebnisse zum Bindungsverhalten von cyt c an Lipidmembranen qualitativ zu reproduzieren [1]. Es geht hier im wesentlichen um das Sättigungsverhalten der sogenannten Bindungsisotherme (u.a. Abschnitt 5.3). Diese beschreiben den Anteil der an die Membran gebundenen cyt c Moleküle in Abhängigkeit von der Gesamtkonzentration. Nachdem in Abschnitt 5.4 gezeigt wird, wie man durch Verwendung einer effektiven Simulationsbox periodische Randbedingungen umgehen kann, wird in Abschnitt 5.5 ein erster Schritt in Richtung Einbeziehung von Membranproteinen unternommen. Bisher wurde ja nur eine strukturlose Oberfläche benutzt. Bevor diese sehr einfachen als Punktladungen realisierten Reaktionszentren in Unterabschnitt 5.5.2 eingebaut werden, beschreibt Unterabschnitt 5.5.1 den Einfluß der van der Waals Wechselwirkung der Membran mit den Brownschen Teilchen. Dieser erweist sich als recht gering. Die Reaktionszentren bewirken eine effektive Verringerung der zur Verfügung stehenden Membranfläche und damit das Einsetzen der cyt c-Sättigung bei kleineren Konzentrationen als ohne diese zusätzlichen Ladungen. Im Kapitel 6 werden dann schließlich vereinfachende Modelle für ein Photosystem vorgestellt. Anhand mittlerweile bekannter 3D-Strukturen wurde die Geometrie der beteiligten Membranproteine und deren Ladung abgeschätzt und auf das Simulationssystem angewandt. Wesentliche Bestandteile dieses Modells sind die Reaktionszentren innerhalb eines Rings aus Lichtsammlerkomplexen (LHC). Es zeigt sich, daß die Verteilung von cyt c, welches mit diesen Membrankomplexen wechselwirkt, deren Struktur in etwa abbildet. Ein Elektronentransfer kann nur stattfinden, wenn cyt c auch tatsächlich die Möglichkeit besitzt, das Reaktionszentrum einer photosynthetischen Einheit zu erreichen, um dort sein Elektron abzugeben. Die farbcodierten Verteilungsdiagramme zeigen aber für unsere Modelle eine vernachlässigbare Dichte. Cyt c kommt also gar nicht durch den Wall von Lichtsammelkomplexen mit seiner ringformigen Struktur hindurch und damit auch nicht nahe genug an das Reaktionszentrum heran. Die Schlußfolgerung ist, daß die benutzten Modelle für solche Photosysteme offensichtlich nicht ausreichen. Es ist möglich, daß diese Art der Modellierung der photosynthetischen Einheiten prinzipiell zu ungenau ist. Es läßt sich aber auch die Hypothese aufstellen, daß der Ring aus Lichtsammelkomplexen in Wirklichkeit nicht vollständig geschlossen ist, sondern an einer Stelle eine "Lücke" aufweist. Durch diese könnten sich die cyt c Moleküle hindurchbewegen und zum Reaktionszentrum gelangen. Das gegenwärtig in der Literatur diskutierte PufX Polypeptid an einer Stelle des Ringes, wo eigentlich ein Lichtsammlerkomplex zu erwarten wäre, könnte dafür verantwortlich sein, daß an dieser Stelle genug Platz für cyt c bliebe, um den Ring zu "durchtunneln". Es folgt dann in Kapitel 7 die Zusammenfassung der Arbeit mit den Schlußfolgerungen und einem Ausblick auf die Forschung, die mit Hilfe der vorliegenden Ergebnisse und des Source Codes möglich sein sollte. Der Anhang gibt dann noch einen Überblick über die benutzten Systemparameter in den verschiedenen Simulationen und zeigt einige Details der Ein- und Ausgabe des vorgestellten Programms.