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Sylke Pioch

• Die NO-sensitive Guanylat-Cyclase (GC), der wichtigste physiologische Rezeptor für Stickstoffmonoxid (NO), ist an der Produktion des sekundären Botenstoffes cGMP beteiligt. Die GC ist ein obligates Heterodimer bestehend aus je einer alpha- und einer beta-Untereinheit, wobei die alphabeta-Isoform am häufigsten vorkommt. Die Bindung von NO an die prosthetische Häm-Gruppe der beta-Untereinheit führt zur Aktivierung des Enzyms. Das dabei gebildete cGMP bindet an Effektorproteine wie Proteinkinase G, Phosphodiesterasen und Ionenkanäle und vermittelt dadurch seine zellulären Effekte. Der Mechanismus der NO-induzierten Aktivierung der GC ist weitgehend bekannt; hingegen ist bisher nur wenig über alternative Regulationsmodi der GC wie zum Beispiel Phosphorylierung, Protein-Protein-Interaktion oder Translokation bekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es daher, die Phosphorylierung der GC durch Tyrosinkinasen der Src-Familie sowie den GC-Interaktionspartner AGAP1 zu untersuchen. Die Tyrosinphosphorylierung der GC konnte in Gegenwart von Protein-Tyrosinphosphatase-Inhibitoren wie Pervanadat erstmals in endogenen Zellen wie Thrombozyten und vaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit dem Inhibitor SU6656 zeigten, dass Kinasen der Src-Familie an der Pervanadat-induzierten Phosphorylierung beteiligt sind. In Überexpressionssystemen wurde die GC durch Src und Fyn phosphoryliert, wobei Src hier deutlich effektiver war. Zudem kann Src die beta-Untereinheit der GC in vitro direkt phosphorylieren. Die Verwendung von Kinase-knockout-Zellen zeigte, dass neben Src auch andere Kinasen die GC-Phosphorylierung vermitteln können. Src interagiert mit dem Holoenzym der GC, wenn der Tyrosinrest 192 der beta-Untereinheit phosphoryliert ist. Hierbei bindet Src über seine SH2-Domäne an die GC. Mit der GC assoziiertes Src kann mindestens einen weiteren Tyrosinrest der beta-Untereinheit phosphorylieren. Ferner weisen einige Resultate auf eine zweite Bindungsstelle hin, die unabhängig von Tyrosin-192 und der SH2-Domäne ist. Experimente zur Lokalisation deuten auf eine möglicherweise durch Src vermittelte Translokation der Guanylat-Cyclase zur Plasmamembran hin. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit AGAP1, einem etablierten Interaktionspartner der GC. AGAP1 ist am endosomalen Vesikeltransport beteiligt, indem es die Aktivität von Arf-GTPasen Phospholipid-abhängig stimulieren kann. In dieser Arbeit zeigte sich, dass AGAP1 über seinen N-Terminus sowie einen oder mehrere Segmente des C-Terminus dimerisiert. Außerdem kann AGAP1 über seine Pleckstrin-Homologie-Domäne an Phosphatidylinositol- Monophosphate und Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphat binden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Arbeit neue potentielle Regulationsmechanismen der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase durch Tyrosinphosphorylierung und durch die Interaktion mit der Tyrosinkinase Src und dem Multidomänen-Protein AGAP1 auf. Hierbei wird deutlich, dass der NO/cGMP-Signalweg, die Tyrosinphosphorylierungs-Kaskaden und der Vesikeltransport regulatorisch ineinander greifen.
• NO-sensitive guanylyl cyclase (GC) is the most important physiological receptor for nitric oxide (NO) and is responsible for production of the secondary messenger cyclic GMP (cGMP). GC is an obligate heterodimer consisting of alpha and beta subunits, with alphabeta as the most abundant isoform. Binding of NO to the prosthetic heme group leads to the activation of the enzyme. Cellular effects of cGMP are mediated by effector proteins such as cGMP-dependent protein kinases, phosphodiesterases and cGMP-gated ion channels. The mechanism underlying the NO-induced activation of GC in vitro has been studied extensively. However, there is little known about the regulation of GC in vivo, for example by posttranslational modifications, subcellular localization or protein-protein-interaction. The major aims of this thesis were to characterize phosphorylation of the alphabeta isoform by tyrosine kinases of the Src family and the GC interacting protein AGAP1. Tyrosine phosphorylation of NO-sensitive guanylate cyclase was shown in rat thrombocytes and rat vascular smooth muscle cells after inhibition of protein tyrosine phosphatases by pervanadate. The role of Src family kinases for the pervanadate-induced phosphorylation was confirmed by inhibition through SU6656. GC was also phosphorylated by Fyn and Src in overexpression systems, with the latter being more effective. In addition, recombinant Src also phosphorylated the beta subunit of GC in vitro. In cells deficient for Src, Yes and Fyn, the beta subunit was still phosphorylated in the presence of pervanadate indicating that kinases other than Src and Fyn can phosphorylate GC as well. The present work also demonstrated that Src interacts with the GC holoenzyme via its SH2 domain. This is mediated by binding to phosphorylated tyrosine 192 of the beta subunit. Following binding to GC, additional tyrosine residues were phosphorylated by Src. Preliminary experiments revealed that a second binding site independent of tyrosine 192 and the SH2 domain may exist. Colocalization studies point to a Src mediated translocation of the NO-sensitive guanylate cyclase to the plasma membrane. A second aspect of this thesis addressed the role of AGAP1, an established protein interaction partner of GC. It could be shown that AGAP1 forms homodimers through both its N- and C-terminal regions. Notably, AGAP1 is involved in the transport of endosomal vesicles by stimulating the GTPase activity of Arf-GTPases, dependent on the presence of phospholipids. This work demonstrates for the first time that the pleckstrin homology domain of AGAP1 can directly bind to phospholipids, with phosphatidylinositol monophosphates and phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate showing strongest binding. Taken together, this thesis suggests that tyrosine phosphorylation as wells as interaction with the tyrosine kinase Src and the multidomain protein AGAP1 may represent new mechanisms regulating NO-sensitive guanylate cyclase. Thus, it becomes apparent that crosstalk between the NO/cGMP pathway, tyrosine phosphorylation and vesicle transport may exist.