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Jörg Fritscher

• One of the most important tasks in chemistry and especially in structural biology has always been the elucidation of three-dimensional molecular structures - either of small molecules or large biopolymers. Among the (bio)physical methods to acquire structural data at atomic resolution electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is the most valuable technique for obtaining structural information about many different kinds of paramagnetic species. In biological systems, either paramagnetic metal ions/clusters, transient paramagnetic intermediates in electron transfer processes or artificially attached stable spin labels can be found. The usual approach to interpret EPR spectra is to perform simulations based on the so-called spin Hamiltonian (SH). This means that the well-defined numerical parameters (tensors) in the SH representing different types of interaction are obtained by fitting the experimental data. The SH parameters include electronic g-values, hyperfine coupling (HFC) and quadrupole coupling (&C) constants, zero-field splittings and constants to describe exchange and dipolar interactions between electron spin systems. However, since the SH only contains spin degrees of freedom, a direct translation of the SH EPR parameters into structural information is not straightforward. Therefore, methods to predict such SH interaction parameters starting from molecular structures are required. In this thesis it was investigated whether quantum chemical calculations of EPR parameters based on density functional theory (DFT) methods may be employed to overcome these problems thus enabling a correlation of experimental EPR data with molecular structure. It was the central goal of this work to point out the potential of a fruitful interplay between quantum chemistry and experiment and to study how both can benefit from each other. For this purpose DFT methods were applied to a variety of organic radical or transition metal systems to calculate different EPR parameters. Using the 'broken symmetry' formalism it was possible to compute the exchange coupling constant for a nitroxide biradical and furthermore decompose the exchange mechanism in different through-bond and through-space interactions. Spin density distributions, 14N and 1H HFC constants as well as dipole moments and polarizabilities were computed for a number of aromatic nitroxides to examine their properties and select promising candidates which may serve as DNA-intercalating spin labels. Systematic investigations of the influence of hydrogen bond geometry on the 14N QC parameters for imidazole-water and methylimidazole-benzosemiquinone complexes lead to the conclusion that especially the imidazole amino nitrogen &C parameters are very sensitive probes of the bond geometry, in particular of the hydrogen bond length. The results of this study may be applied to biological systems, e.g. to gain structural information about quinone binding sites. Moreover, quantum chemical methods were applied to elucidate the structure of a nitrogen-centered radical intermediate in the inhibition process of ribonucleotide reductase (RNR). It was possible to find a molecular structure in accordance with all experimentally available data, thus revealing the longsought structure of the No radical and providing evidence for the trapping of a 3'-ketonucleotide in the reduction process catalyzed by RNR. To test the capability of modern DFT methods to predict g- and molybdenum HFC tensors for MoV complexes, validation studies were carried out. Comparison of computed EPR parameters of a number of MoV compounds with corresponding experimental values showed that g- and HFC tensors could be predicted in good accuracy, although some systematic errors of the computational methods have to be considered for such heavy 4d1 transition meta1 systems. Furthermore, DFT calculations on a Mn2+ binding site model of the hammerhead ribozyme allowed to conclude that the structure of the binding site as studied by EPR spectroscopy in frozen solution is very likely to be identical to the site found occupied by Mn2+ in crystals. Finally, computational methods were employed to aid in the structural characterization of the Mn2+ binding site in Ras (rat sarcoma protein) by providing accurate starting parameters for spectral simulations and furthermore helping to interpret the experimental data. In conclusion, it was demonstrated in this thesis that the combination of sophisticated experimental and quantum chemical methods represents a powerful approach in the field of EPR spectroscopy and that it may be essential to employ EPR parameter computations to extract the full information content from EPR spectra. Therefore, great potential lies in future applications of DFT methods to the large number of systems where detailed and reliable experimental data is available but where an unequivocal correlation of these data with structural information is still lacking.
• Eine der wichtigsten Aufgaben der Chemie und besonders der Strukturbiologie ist es, dreidimensionale molekulare Strukturen von kleinen Molekülen oder großen Biopolymeren aufzuklären. Unter den biophysikalischen Methoden zur Struktur­untersuchung mit atomarer Auflösung ist die elektronenparamagnetische Resonanz­spektroskopie (EPR-Spektroskopie) das wichtigste Werkzeug, um strukturelle Informationen über viele verschiedene Arten von paramagnetischen Spezies zu gewinnen. In biologischen Systemen findet man paramagnetische Metallionen oder Metallcluster, transiente paramagnetische Intermediate in Elektronen­transfer­pro­zessen oder künstlich angebrachte Spinlabel. Zur Analyse von EPR-Spektren versucht man in der Regel, diese mit Hilfe des sogenannten Spin-Hamiltonoperators (SH-Operators) zu simulieren. Dies bedeutet, dass man die im SH-Operator definierten numerischen Parameter (Tensoren), die verschiedene physikalische Wechselwirkungen repräsentieren, durch Anpassung an die experimentellen Daten bestimmt. Zu den SH-Parametern gehören elektronische g-Werte, Hyperfeinwechselwirkungs- (HFC) und Quadrupol­kopplungskonstanten (QC-Konstanten), Nullfeldaufspaltungen und Konstanten, die die Austausch- und dipolaren Wechselwirkungen zwischen Elektronenspins beschreiben. Da der SH-Operator allerdings nur Spinfreiheitsgrade und das äußere Magnetfeld beinhaltet, ist eine direkte Übersetzung der SH-EPR-Parameter in Strukturdaten oft schwierig. Aus diesem Grund benötigt man Methoden, um die SH-Parameter ausgehend von molekularen Strukturen vorhersagen zu können. In dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob quantenchemische Berechnungen von EPR-Parametern, die auf Dichtefunktionaltheorie (DFT) basieren, verwendet werden können, um die beschriebenen Probleme zu lösen und eine Korrelation zwischen experimentellen EPR-Daten und molekularer Struktur zu erreichen. Das zentrale Ziel dieser Arbeit war es, das große Potential des Zusammenspiels von Quantenchemie und Experiment herauszustellen und zu untersuchen, wie beide Methoden vonein­ander profitieren können. Zu diesem Zweck wurden DFT-Methoden auf verschiedene paramagnetische Systeme angewendet, um deren EPR-Eigenschaften zu berechnen. Zu den untersuchten Systemen gehören sowohl organische Radikale als auch Übergangs­metall­komplexe. Unter Verwendung des „Broken-Symmetry“-Formalismus war es möglich, die Aus­tauschwechselwirkungskonstante für ein Nitroxidbiradikal zu berechnen. Außerdem war es möglich, die Wechselwirkung im Detail zu analysieren und in Anteile, die durch den Raum bzw. durch Bindungen vermittelt werden, aufzuteilen. Für eine Reihe von aromatischen Nitroxiden wurden Spindichteverteilungen, 14N- und 1H-HFC-Konstanten sowie Dipolmomente und Polarisierbarkeiten vorhergesagt, um ihre magnetischen Eigenschaften zu untersuchen und solche Verbindungen heraus­zusortieren, die als DNA-interkalierende Spinlabel geeignet sein könnten. Mittels systematischer Untersuchungen des Einflusses von Wasserstoff­brücken­geometrien auf 14N-QC-Parameter an Imidazol–Wasser- und Methylimidazol–Benzo­semi­chinon-Systemen konnte herausgefunden werden, dass insbesondere die Amino­stickstoff-QC-Parameter sehr empfindliche Indikatoren für die Geometrie der Wasserstoffbrückenbindung sind. Besonders großen Einfluss auf die QC-Parameter hat hierbei die Länge der Wasserstoffbrücke. Die Ergebnisse dieser Studie können auch auf biologische Systeme angewandt werden, z.B. um Einblicke in die Struktur von Chinonbindungstaschen zu gewinnen. Im Zusammenhang mit der Anwendung von DFT-Methoden auf organische Radikale in biologischen Systemen wurden quantenchemische Berechnungen verwendet, um die Struktur eines stickstoffzentrierten Radikalintermediats des Inhibitionsprozesses von Ribonukleotidreduktase (RNR) aufzuklären. Es war möglich, eine Molekülstruktur zu finden, deren Eigenschaften in Übereinstimmung mit den verfügbaren experimen­tellen Daten sind, und die daher der lange gesuchten Struktur des N*;-Radikals entspricht. Diese Strukturaufklärung lieferte gleichzeitig wichtige Hinweise für das Auftreten eines 3'-Ketonukleotids im Reduktionsprozess, der von RNR katalysiert wird. Weiterhin wurde untersucht, ob moderne DFT-Methoden geeignet sind, g- und Molyb­dän-HFC-Tensoren für MoV-Komplexe vorherzusagen. Im Rahmen dieser Validie­rungsstudien wurden die EPR-Parameter für eine Reihe von MoV-Spezies berechnet und mit experimentellen Daten verglichen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass sowohl g- als auch HFC-Tensoren mit zufrieden­stellender Genauigkeit vorhergesagt werden können – auch wenn einige systema­tische Fehler der theoretischen Methoden bei der Behandlung schwerer 4d1-Über­gangs­metallsysteme berücksichtigt werden müssen. DFT-Rechnungen konnten in dieser Arbeit auch dazu eingesetzt werden, um zu zeigen, dass die Struktur der Mn2+-Bindungstasche im Hammerhead-Ribozym, die mittels EPR-Spektroskopie in gefrorener Lösung untersucht worden war, sehr wahrschein­lich identisch ist mit der Struktur der Bindungstasche, die in Kristallen gefunden worden war. Schließlich war es möglich, mit Hilfe quantenchemischer Methoden die strukturelle Charakterisierung der Mn2+-Bindungsstelle in Ras („rat sarcoma protein“) zu unter­stützen. Ausgehend von Kristallstrukturmodellen von Ras wurden DFT-Rech­nungen verwendet, um genaue Startparameter für die Simulation der Spektren zu erhalten und experimentelle Daten zu interpretieren. In dieser Arbeit wurde demonstriert, dass die Kombination von modernen experi­mentellen und quantenchemischen Techniken eine leistungsfähige Methode im Zusammenhang mit der EPR-Spektroskopie darstellt und dass es unabdingbar sein kann, EPR-Parameterberechnungen durchzuführen, um den kompletten Informa­tions­gehalt von EPR-Spektren auszuschöpfen. Aus diesem Grund liegt ein großes Potential in zukünftigen Anwendungen von DFT-Methoden auf die vielen (biologi­schen) Systeme, für die zwar detaillierte und zuverlässige experimentelle Daten vorliegen, bei denen aber eindeutige Korrelationen dieser Daten mit strukturellen Infor­mationen noch immer fehlen.