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Kerstin Meyer-Lipp

• The melibiose permease (MelB) of E.coli functions as a secondary-active symporter by using the electrochemical H+, Na+, or Li+ gradient to accumulate, e.g., melibiose [review in Pourcher et al. 1990a]. The global and primary objective of this thesis was to apply pre-steady state methods for the investigation of reaction rates of individual steps in the cycle of MelB. Especially the melibiose binding induced transition was investigated by the solid-supported membrane (SSM) technique [Seifert et al. 1993] in combination with a rapid solution exchange system [Pintchovius and Fendler 1999] and with the Stopped-flow technique [Roughton 1934]. To approach this goal, either wild-type or mutated MelB were purified and reconstituted into liposomes as described [Pourcher et al. 1995]. Although the orientation of the proteins is a critical factor for the activity of MelB, it was, so far, unknown. To determine the orientation of the proteins in the liposomes, single Cys mutants R139C and R141C [Abdel-Dayem et al. 2003] were selectively labeled with 3-(N-maleimidylpropionyl)biocytin (MPB) and analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. The assay indicated that most of the proteins are inside-out (ISO) oriented permitting to relate the pre-steady state electrical and fluorescence signals to the reverse transport activity of MelB. The melibiose induced electrical signal was investigated in wild-type MelB with the SSM technique. The transporter was activated by a substrate concentration jump, and transient currents were measured. When the transporter was preincubated with Na+ at saturating concentrations, a charge translocation in the protein upon melibiose binding could still be observed. This result demonstrates that binding of the uncharged substrate melibiose triggers a charge displacement in the protein. Further analysis showed that the charge displacement is neither related to extra Na+ binding to the transporter, nor to the displacement of already bound Na+ within MelB. Electrogenic melibiose binding is explained by a conformational change with concomitant displacement of charged amino acid side chains and/or a reorientation of helix dipoles. A kinetic model is suggested, in which Na+ and melibiose binding are distinct electrogenic processes associated with approximately the same charge displacement. Melibiose binding is fast in the presence of Na+ (k > 50 s-1). Furthermore, two previously identified transport deficient mutants of loop 4-5, R141C and E142C [Abdel-Dayem et al. 2002, Séry 2002], were purified and extensively studied with the SSM. Whereas the electrical signals from control cysteine-less mutant showed a bi-exponential time course of decay, those from R141C or E142C consisted of only a single fast exponential component, and the slow decaying component associated with substrate translocation was missing. The electrical signals evoked by a melibiose concentration jump in the presence of Na+ were much smaller than the corresponding signals in C-less MelB. Furthermore, R141C lost the stimulating effect of melibiose on Na+ binding. Steady-state Trp fluorescence spectroscopy revealed impaired conformational changes after melibiose binding in the mutants and fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements indicated that the mutants still show cooperative modification of their sugar binding sites by Na+. These data suggest that loop 4-5 contributes to the coordinated interactions between the ion- and sugar binding site and participates in conformational changes after melibiose binding that are essential for the subsequent obligatory coupled translocation of substrates. By using the Stopped-flow technique, three different approaches were followed. First, the intrinsic Trp fluorescence of MelB, known to increase upon melibiose binding [Mus-Veteau et al. 1995], revealed a signal with a T 1 of ~15 ms in C-less. This time constant is of the same order of magnitude as that determined with the SSM method suggesting that Trp fluorescence and electrical signal are related processes. Conformation for this assumption came from the fact that the activation energies Ea for both processes are similar (around 45 KJ/mol). Second, by using the fluorescent sugar analog Dns2-S-Gal, which monitors events close to the sugar binding site [Maehrel et al. 1998], a signal with a T 1 of ~18 ms was recorded upon Na+ addition. Finally, the fluorescent dye MIANS was used to selectively label the single Cys mutant E365C of loop 10-11. Stopped-flow measurements revealed a melibiose-induced fluorescent signal with a T 1 of 45 ms. Since electrical measurements with the MIANS-labeled E365C excluded the possibility that the label is responsible for the slower kinetics, the conformational change detected by the MIANS fluorescence was assigned to a slow transition in the cycle of MelB after melibiose binding. Ea was determined to be 96 KJ/mol corroborating, thus, the hypothesis of a different process. In conclusion, it was possible to correlate the electrical and fluorescence signals to partial reactions of the transport cycle and to determine their rate constants. According to this new model, the melibiose-induced signal detected with the Trp and electrical measurements corresponds to a step preceding the carriers’ reorientation (3 <-> 3*, k ~ 65s-1), and the melibiose-induced signal detected with the MIANS fluorescence to the reorientation itself (3* <-> 4, k ~ 20s-1).
• Um die Aufnahme und Abgabe von organischen Substraten und Ionen in die Zelle zu ermöglichen, besitzt die Plasmamembran eine Reihe von verschiedenen Transportsystemen. Die Melibiose Permease (MelB) in der zytoplasmatischen Membran von Escherichia Coli ist ein solches Transportsystem und gehört zur Familie der Glykosid-Pentosid-Hexuronid-Transporter. MelB besteht aus 473 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 53 kDa. Das Protein ist sehr hydrophob (70% apolar) und hat zwölf Transmembrandomänen mit alpha-helikaler Konformation [Botfield et al. 1992, Gwizdek et al. 1997, Hacksel et al. 2002, Pourcher et al. 1990a]. Der Transport verschiedenster Substrate durch biologische Membranen ist an bereits existierende Gradienten anderer Substrate oder Ionen gekoppelt (sekundärer Transport). So nutzt zum Beispiel MelB den durch andere Systeme geschaffenen elektrochemischen Natriumgradienten, um akkumulierend ein Substrat (zum Beispiel alpha-Galaktoside wie Melibiose oder beta-Galaktoside wie Methyl-1-thio-beta-D-galaktopyranosid) in die Zelle zu befördern. MelB kann als kotransportierende Ionen neben Natrium auch Lithium und Protonen verwenden [Bassilana et al. 1985, Lopilato et al. 1978, Pourcher et al. 1995, Tsuchiya et al. 1978, Tsuchiya et al. 1980, Tsuchiya et al. 1983, Tsuchiya & Wilson 1978, Wilson & Wilson 1987]. Die Kosubstrate binden an den Transporter mit einer Stoichiometrie von 1:1. Des weiteren erhöht die Bindung des Kations die Affinität des Transporters für den Zucker, wobei Na+ und Li+ bessere Aktivatoren als H+ sind. MelB katalysiert die gekoppelte Translokation von Na+ (H+ oder Li+) und Zuckern ebenfalls mit einer Stoichiometrie von 1:1. Die Substratbindung an der Außenseite und die Substratdissoziation ins Zytoplasma erfolgen geordnet, d. h. Na+ bindet zuerst gefolgt von Zucker, wohingegen der Zucker zuerst dissoziiert gefolgt von Na+ [Bassilana et al. 1987, Damiano-Forano et al. 1986, 1988, Pourcher et al. 1990a]. Dabei erhöht das Membranepotential den aktiven Transport, indem es die Rate der Na+-Dissoziation in das Zytoplasma erhöht. Wenn Melibiose in der Zelle ist, wird es von der alpha-Galaktosidase in Glukose und Galaktose gespalten, die beide von der Zelle verstoffwechselt werden und der Energieproduktion dienen. MelB ist ein besonders interessantes Protein für die Untersuchung des Transport-mechanismus, da es verschiedene Zucker und Kationen als Substrate nutzt. Außerdem läßt das Protein sich in großen Mengen herstellen, aufreinigen und in Liposomen rekonstituieren [Pourcher et al. 1995]. Die Melibiose Permease besitzt strukturelle und funktionelle Homologie zu anderen Na+-/Substrat-Kotransportern, die bei biologisch und medizinisch relevanten Prozessen wichtige Funktionen einnehmen. Trotz ihrer Bedeutung sind die Kenntnisse zur Struktur und Funktionsweise dieser Transportproteine sehr begrenzt und deren Aufklärung bleibt weiterhin eine große Herausforderung. MelB dient dabei als Modell, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sekundär aktiver Na+-Kotransporter besser zu verstehen. Damit können generelle Prinzipien zur Funktionsweise formuliert werden, die auch auf eukaryotische Transporter angewandt werden können, die bei pathophysiologischen Prozessen eine Rolle spielen. Bisher wurden hauptsächlich stationäre Messungen durchgeführt, die einen Einblick in den Gesamtreaktionsmechanismus von MelB gegeben haben [Pourcher et al. 1990a]. Vor kurzem wurden elektrogene Vorgänge, die durch die Aktivität von MelB verursacht worden sind, zum ersten Mal untersucht [Ganea et. al. 2001]. Hierzu wurden Proteoliposomen, die den gereinigten MelB-Transporter enthielten, auf eine festkörperunterstützte Membran (SSM) adsorbiert. Diese Technik ist besonders interessant, da mit Hilfe eines schnellen Lösungs-wechsels Konzentrationssprünge von nahezu jedem beliebigen Substrat an der SSM durchgeführt werden können. Bei dieser ersten Charakterisierung wurde festgestellt, daß die Na+-Bindung an MelB eine Ladungsverschiebung innerhalb des Proteins auslöst, die sich in einer schnell abfallenden Komponente eines transienten Stromsignals widerspiegelt. Mehrere Zwischenschritte innerhalb des Reaktionszyklus wurden bisher nicht oder nur ungenügend charakterisiert. Deswegen bestand die grundlegende Zielsetzung dieser Arbeit darin, vorstationäre, oder pre-steady state Methoden, zur Untersuchung einzusetzen. Diese erlauben es, Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten von einzelnen Schritten im Reaktions-zyklus von MelB aufzulösen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden der Wildtyp und verschiedene mutierte Transporter solubilisiert, aufgereinigt und anschließend in Liposomen rekonstitutiert, wie es bereits für MelB beschrieben worden ist [Pourcher et al. 1995, Rigaud et al. 1995]. Die Methode der Aufreinigung und Rekonstitution hat den Vorteil, daß man ohne Wechselwirkung mit anderen zellulären Proteinen die Eigenschaften von MelB untersuchen kann. Die Proteoliposomen wurden in dieser Arbeit hauptsächlich mit der SSM und der Stopped-Flow-Technik untersucht. ...