Open Access

Marcel Adler

• IL-12-related cytokines produced by dendritic cells are considered to be major inducers of adaptive immune system activation upon innate antigen-sensing. IL-23 specifically is currently being discussed to support the differentiation of potentially auto-aggressive Th17 cells. Prostaglandins as bystander cell products are known to modulate the translation of this process. While previous studies focused therefore on IL-12, ignoring the existence of new IL-12-related cytokines IL-23 and IL-27, this study analysed effects of prostaglandin E2, D2 and 15d-PGJ2 on the secretion pattern of these subunits in the murine immature Langerhans cell line XS52 and the murine immature myeloid dendritic cell line JawsII under TLR4 (LPS) and TLR9 (CpG) stimulation as well as effects of prostaglandins on the murine Th1 cell line IF12 in coculture and upon Con A treatment. In serial semi-quantitative RT-PCR of the IL-12 related cytokines of the XS52 cell line and the JawsII cell line, the p40 subunit was upregulated in both DC cell lines upon TLR-stimulation, the IL-23p19 subunit constantly expressed in XS52 and upregulated in JawsII upon TLR-stimulation, while the IL-27p28 subunit was only weekly expressed under additional stimulating aCD40 Ab treatment. IL-12p35 could only be detected in the immature myeloid cell line. The protein expression of the p40 subunit was measured in Western blot assays following SDS-PAGE under reducing conditions in XS52. The Western blot-based antibody specification allowed the establishment of a p40-specific ELISPOT assays, where overadditive upregulation of the number of LPS-stimulated spot forming XS52 cells was observed under stimulation with PGE2 while PGD2 depressed the number of LPS-stimulated cytokine secreting cells. Contrary IL-12p40 could not be detected in supernatants of the JawsII cell line. Both DC cell lines were further tested for differential response towards different TLR stimulation described as a defining feature of DC subsets. While subunit expression on transcription level did not differ, only LPS-treatment led to constant IL-12p40 expression in supernatants of XS52. CpG-treatment of XS52 cells led to constantly high IL-12p40 levels under additional aCD40 Ab treatment. In IFN-g ELISPOT assays, prostaglandin effects were further analysed in IF12 Th1 cells upon Con A treatment or alternatively upon treatment in a coculture model with the syngeneic cell line XS52 and the T lymphocyte-specific protein ovalbumin. While PGE2 depressed the amount of activated Th1, PGD2 showed no effect. In conclusion, a coculture model has been generated that allows the analysis of DC and TC interactions. The importance of prostaglandins as differential regulators in time- and tissue-dependence in inflammatory processes has been demonstrated. These results accord with recent observations of an upregulation of IL-23 secretion upon PGE2 treatment.
• Die von dendritischen Zellen freigesetzten Zytokine der IL-12 Gruppe sind maßgeblich an der Übersetzung der unspezifischer Aktivierung des angeborenen Immunsystems zur adaptiven Immunantwort beteiligt. Besonders Interleukin-23 wird gegenwärtig als unterstützendes Zytokin einer potentiell autoaggressiven Th17-Antwort diskutiert. Es wurde gezeigt, daß die von Stromazellen freigesetzten Prostaglandine diese Aktivierungsmechanismen beeinflussen. Einflüsse auf die kürzlich charakterisierten IL-12-verwandten Zytokine IL-23 und IL-27, von denen ersteres eine gemeinsame Untereinheit mit IL-12 teilt, wurden in früheren Studien nicht berücksichtig. Die vorliegenden Arbeit stellt eine Untersuchung der Effekte der Prostaglandine PGE2, PGD2 und dessen Abbauprodukts 15d-PGJ2 auf die Expression der Untereinheiten der IL-12 Gruppe in der murinen immaturen Langerhans Zellinie XS52 und der murinen immaturen myeloiden dendritischen Zellinie JawsII nach TLR4- (LPS) und TLR9- (CpG) Stimulierung dar. In weiteren Versuchen wurde der Prostaglandineinfluß auf Th1 Zellen (IF12) in Cokultur als auch nach Con A-Stimulierung untersucht. Ergebnisse von seriellen semi-quantitativen RT-PCR der Zytokinuntereinheiten der IL-12 Gruppe in XS52 und JawsII Zellen zeigten eine Hochregulierung der p40-Expression auf mRNA-Ebene nach TLR-Stimulation. Die IL-23p19 Untereinheit wurde in XS52 Zellen konstant transkribiert, in JawsII Zellen nach TLR-Stimulation hochreguliert. Die IL-27p28 Untereinheit wurde nur schwach und nur nach Stimulierung mit zusätzlichen aCD40-spezifischen stimulierenden Antikörper transkribiert. IL-12p35 konnte nicht in XS52 Zellen nachgewiesen werden, wohl aber in JawsII Zellen. Mittels Western blot assays nach reduzierenden SDS-PAGE wurde p40 in Zellkulturüberständen detektiert. Die Antikörperspezifierung durch Western blot assay erlaubte die Etablierung eines p40-spezifischen ELISPOT assays. Überadditiv steigerte PGE2 unter LPS-Stimulierung die Anzahl der Spot forming cells, während PGD2 die Anzahl der aktivierten Zellen verringerte. In JawsII-Zellkulturüberständen konnte p40 nicht nachgewiesen werden. Beiden Zellinien wurde auf eine differentielle Expression der IL-12 Untereinheiten nach verschiedenartiger TLR-Stimulierung, als definierendes Merkmal von unterschiedlichen DC Linien untersucht. Während die Transkription unbeeinflußt blieb, wurde nur in Zellkulturüberständen von XS52 nach LPS-Stimulierung eine konstante Proteinexpression nachgewiesen. CpG-Behandlung führte zu konstant hoher Expression nach zusätzlicher stimulierender aCD40-Stimulierung. In IFN-g ELISPOT assays wurden Prostaglandineffekte auf die Th1 Zellinie IF12 nach Con A-Behandlung und alternativ im Cokultur Modell mit syngenen XS52 und dem T Lymphozyten-spezifischen Protein Ovalbumin untersucht. Während PGE2 die Anzahl der aktivierten Th1 senkte, hatte PGD2 keine Wirkung. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein Cokultur Modell entwickelt, das die Untersuchung von DC and TC Interaktionen erlaubt. Die Wichtigkeit von Prostaglandinen als differentielle Regulatoren in Zeit- und Ortsabhängigkeit bei inflammatorische Prozessen wurde dargelegt. Diese Ergebnisse stimmen mit kürzlich veröffentlichten Publikationen, die eine isolierte Hochregulierung der IL-23 Sekretion bei unveraänderter IL-12 Expression nach PGE2-Behandlung beschreiben, überein.