Open Access

Daniel Börgel

• Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
• In the present PhD thesis the sphingolipid biosynthesis pathway of the yeast Pichia ciferrii should be analyzed in more detail to develop a fermentative route to sphingosine production. Additionally a patentable selection system for this yeast should be established. By sequence comparisons with closely related other yeasts and deducing degenerated primers eleven genes of the sphingolipid biosynthesis pathway of Pichia ciferrii could be isolated and sequenced: LCB1 (encodes a subunit of serine palmitoyltransferase), TSC10 (3-ketosphinganine reductase), LAG1 and LAF1 (ceramide synthases), LIP1 (subunit of ceramide synthases), DES1 (dihydroceramide-delta4-desaturase), YXC1 (ceramidase), 8DES (sphingolipid-delta8-desaturase), 9MTR (sphingolipid-C9-methyltransferase), GCS1 (ceramide glycosyltransferase) and LCB4 (LCB kinase). Bioinformatics as well as in vivo experiments served as tools for classification of the corresponding gene products into the metabolic pathway. Classification of substrate specificities of single enzymes out of the sphingolipid biosynthesis pathway have been performed by overexpression of corresponding genes and following determination of the influence on the constitution of the sphingolipid fraction of Pichia ciferrii. Taken together these results gave a more distinct picture of sphingolipid biosynthesis in the yeast Pichia ciferrii. The gained knowledge on sphingolipid biosynthesis in Pichia ciferrii has then been implemented into the genetical engineering to form a sphingosine production strain. By combined overexpression of genes encoding for dihydroceramide-delta4-desaturase of Pichia ciferrii, ceramide-synthase of Coccolithovirus and an alkaline ceramidase of Mus musculus an 8.5 fold increase of sphingosine concentration from 7.5 mg/l in a WT derived syringomycine-E resistant strain up to 64.0 mg/l has been obtained. Codon adaptation of heterologously expressed genes to Pichia ciferrii's highly restricted codon usage turned out to be essential. For utilization of recombinant Pichia ciferrii strains for industrial purposes three new selection systems have been established. A codon optimized version of the nat1 gene has been used to gain a nourseothricine resitance in Pichia ciferrii. Additionally stable uracil and lysine auxotrophic Pichia ciferrii strains have been generated. These auxotrophic strains were then complemented by integration vectors containing the marker genes URA3 and LYS2 respectively. Taken together with the first disruption of a gene in Pichia ciferrii (SYR2 encoding for sphinganine hydroxylase) the molecular biological handling of Pichia ciferrii has been greatly improved.