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Andreas Weigert

• The removal of apoptotic cells (AC) can be regarded as an integral component of the program to terminate inflammation. Clearance of AC by professional phagocytes such as macrophages induces an anti-inflammatory phenotype in the latter ones. Anti-inflammatory or M2 polarization is also observed in macrophages infiltrating certain human tumors. These tumor-associated macrophages (TAM) contribute actively to tumor progression by promoting immune evasion, angiogenesis and tumor cell survival. The aim of my Ph.D. thesis was to approach the mechanisms as well as the characteristics of macrophage phenotype alterations induced by AC, and to elucidate a possible connection between tumor cell apoptosis and TAM generation. In the first part of my studies, I investigated the impact of AC on macrophage viability. I could show that macrophage survival against pro-apoptotic agents increased after the interaction with AC. Protection of macrophages against cell death required activation of phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K), extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) and Ca2+ signaling, and correlated with Bcl-XL and Bcl-2 up-regulation as well as Ser136-Bad phosphorylation. Unexpectedly, neither phagocytosis nor binding of apoptotic debris to the phagocyte was necessary to induce protection. AC released the bioactive lipid sphingosine-1-phosphate (S1P), dependent on sphingosine kinase (SphK) 2, as a survival messenger. These data indicated an active role of AC in preventing cell destruction in their neighborhood. My next aim was to elucidate the mechanism of S1P production by AC. During cell death, SphK 2 was cleaved at its N-terminus by caspase-1. Thereupon, the truncated but enzymatically active fragment of SphK 2 was released from cells. This release was coupled to phosphatidylserine exposure, a hallmark of apoptosis and a crucial signal for the phagocyte/apoptotic cell interaction. Thus, I observed a link between common signaling events during apoptosis and the extracellular production of S1P, which is known to affect immune cell attraction and polarization as well as angiogenesis in cancer. In the next part of my studies, I asked for a correlation between tumor cell apoptosis and TAM polarization. During co-culture of human macrophages with human breast cancer carcinoma cells (MCF-7), the latter ones were killed, while macrophages acquired an alternatively activated phenotype. This was characterized by decreased tumor necrosis factor (TNF)-α; and interleukin (IL)-12-p70 production, but increased formation of IL-8 and IL-10. Alternative macrophage activation required tumor cell death, because a co-culture with apoptosis-resistant colon carcinoma cells (RKO) or Bcl-2-overexpressing MCF-7 cells failed to induce phenotype alterations. These phenotype alterations were also achieved with conditioned media from apoptotic tumor cells, which again argued for a soluble factor being involved. Knock-down of SphK2, but not SphK1, to attenuate S1P formation in MCF-7 cells, repressed the otherwise observed alternative macrophage polarization during co-culture. Furthermore, macrophage polarization achieved by tumor cell apoptosis or substitution of authentic S1P was characterized by suppression of pro-inflammatory nuclear factor (NF)-κB DNA binding. These findings suggested that tumor cell apoptosis-derived S1P contributes to the macrophage polarization present in human tumors. To validate these in vitro data, I used an in vivo tumor model to clarify the relevance of SphK2 and S1P in tumor development. The growth of, as well as blood vessel infiltration into SphK2 knock-down MCF-7 (MCF-7-siSphK2) xenografts in nude mice was markedly decreased in comparison to control MCF-7 xenografts. In contrast, macrophage infiltration was similar or even more pronounced. These data provided a first hint for an in vivo role of SphK2-derived S1P in macrophage polarization associated with tumor promotion. In summary, these data indicate a new mechanism how AC themselves shape macrophage polarization, which results in the termination of inflammatory responses and macrophage survival. Furthermore, my studies present evidence that human tumors may utilize this mechanism to foster growth via increased angiogenesis.
• Die Phagozytose apoptotischer Zellen (AZ) kann als ein integraler Bestandteil des Mechanismus zur Beendigung von Entzündungsreaktionen angesehen werden. Die Beseitigung von AZ induziert einen anti-inflammatorischen Phänotyp in Makrophagen. Ein ähnlicher Phänotyp (M2) ist auch für Makrophagen beschrieben, die in humane Tumore infiltrieren. Diese Tumor- assoziierten Makrophagen (TAM) tragen aktiv zur Tumorprogression bei, indem sie die Gefäßbildung und das Überleben von Tumorzellen fördern, aber auch das körpereigene Immunsystem ausschalten. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, die Mechanismen und Charakteristika der Makrophagenpolarisierung durch AZ besser zu verstehen, und eine mögliche Verbindung von Tumorzell-Apoptose und der Ausprägung des TAM-Phänotyps aufzuzeigen. Im ersten Teil meiner Studien untersuchte ich den Einfluss von AZ auf die Überlebensfähigkeit von Makrophagen. Diese war nach der Interaktion mit AZ erhöht. Der Schutz vor Zelltod benötigte die Aktivierung der Phosphatidylinositol-3 Kinase (PI3K), der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2, sowie Calcium-Signale, und korrelierte mit vermehrter Expression von Bcl-2 und Bcl-XL, sowie mit Phosphorylierung von Bad an Ser136. Interessanterweise war der Schutzeffekt unabhängig von Phagozytose oder direkter Interaktion zwischen Makrophagen und AZ, sondern vielmehr von der Freisetzung des bioaktiven Lipids Sphingosin-1-Phosphat (S1P) aus AZ, generiert durch die Sphingosinkinase (SphK) 2. Mein nächstes Ziel war es den dafür verantwortlichen Mechanismus aufzuzeigen. Während des Zelltods fand eine Spaltung der SphK2 durch die Caspase-1 an deren N-Terminus statt, woraufhin ein enzymatisch aktives Fragment aus den AZ freigesetzt wurde. Diese Freisetzung war eng an die Exposition von Phosphatidylserin gekoppelt, welche ein Kennzeichen von Apoptose, und ein wichtiges Signal bei der Interaktion von Makrophagen und AZ ist. Somit konnte ich eine Verknüpfung zwischen allgemeinen Signalwegen der Apoptose und der extrazellulären Produktion von S1P nachweisen. Von letzterem ist bekannt, dass es sowohl die Polarisierung und das Anlocken von Immunzellen, als auch die Gefäßbildung im Tumor beeinflussen kann. Im nachfolgenden Teil meiner Studien untersuchte ich eine mögliche Verbindung zwischen Tumorzell-Apoptose und der TAM- Polarisierung. In einer Ko-Kultur von menschlichen Makrophagen mit MCF-7 Brustkrebszellen wurden letztere getötet, woraufhin die Makrophagen einen alternativ aktivierten Phänotyp annahmen. Dieser war durch verminderte Produktion des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF)-α; und des Interleukins (IL)-12p70 sowie durch erhöhte Freisetzung der Interleukine 8 und 10 charakterisiert. Die alternative Aktivierung der Makrophagen in den Ko-Kulturen war Tumorzelltod-abhängig, da Apoptose-resistente Darmkrebszellen (RKO) oder Bcl-2 überexprimierende MCF-7 Zellen diese nicht auslösten. Dies war jedoch mit Zellkulturüberständen von apoptotischen Tumorzellen der Fall, was wiederum auf einen löslichen Faktor hindeutete. Das Ausschalten der SphK2, nicht jedoch der SphK1, was die S1P- Freisetzung von MCF-7 Zellen unterband, verhinderte die alternative Aktivierung von Makrophagen in den Ko-Kulturen. Ein weiteres Charakteristikum der Makrophagenpolarisierung durch apoptotische Tumorzellen und S1P war die Hemmung der DNA-Bindung des entzündungsfördernden Transkriptionsfaktors NF-κB. Um die Relevanz der SphK2 und von S1P in der Tumorentwicklung genauer zu untersuchen, führte ich ein in vivo Tumormodell durch. Tumorzell-Implantate von SphK2-defizienten MCF-7 Zellen in Nacktmäusen wiesen sowohl deutlich reduziertes Wachstum, als auch Blutgefäßbildung, im Vergleich zu Kontrollimplantaten (MCF-7) auf. Die Einwanderung von Makrophagen war jedoch nicht vermindert, sondern eher erhöht. Diese Daten lieferten einen ersten Hinweis auf eine Rolle von SphK2-abhängig freigesetztem S1P in der Makrophagenpolarisierung, in Verbindung mit einer Förderung der Tumorentwicklung. Zusammengefasst deuten meine Daten auf einen neuen Mechanismus hin, wie AZ die Makrophagenpolarisierung gestalten. Dieser Prozess resultiert letztlich in der Beendigung von Entzündungsreaktionen und erhöhter Überlebensfähigkeit von Makrophagen. Weiterhin weisen meine Studien darauf hin, dass Tumore eventuell diesen Mechanismus nutzen, um ihr Wachstum durch vermehrte Gefäßbildung zu sichern.