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Ankita Roy

• G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute an important class of integral membrane proteins that are involved in several signaling pathways. About 50% of the currently available drugs are targeted against these receptors and high-resolution structures of these receptors will be of immense importance from the perspective of designing specific and potent drugs. However, structure determination of these receptors and of membrane proteins in general, has been a very challenging task till date. A major limitation in the structure determination of these proteins is that they are present in minute amounts in the native tissues and therefore, they must be produced heterologously. Additionally, crystallization of GPCRs is difficult owing to their flexible nature and limited hydrophilic surface area available for crystal contacts. The aim of my Ph.D. thesis work is two fold, first, to address the problem of GPCR crystallization by using a fusion protein complex approach and second, to tailor Rhodobacter sphaeroides as an expression system for the heterologous production of GPCRs. In the first approach, R. sphaeroides was used as an expression system to generate a fusion protein complex of the photosynthetic reaction center (RC) with a GPCR, expecting that such a complex would be easier to crystallize than the receptor alone. The notion behind this approach is that the RC will act as a scaffold in providing surface area to create crystal contacts and at the same time, it will also reduce the flexibility of the receptor, hopefully without perturbing the functionality of the receptor. Based on the computational modelling experiments, two ways to generate a fusion complex were assigned. Long linkers were inserted between the subunits of the RC and the GPCR. The linkers were designed with a possibility of straightforward alteration of their length as they contained a number of restriction enzyme sites. A series of these constructs were designed and expressed in R. sphaeroides deletion strain, which did not possess the chromosomal RC genes. Though most of these fusion constructs could be successfully expressed, as analyzed by western blot, majority of them were not functional in terms of ligand binding of the GPCR component of the fusion complex. Interestingly, one of these constructs, where the M subunit of RC was directly fused to the human angiotensin II type 1a receptor (AT1aR), exhibited significant functional expression. Based on saturation binding analysis using [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8-angiotensin II (an AT1aR subtype specific antagonist), an expression level of 40+5 pmol/mg of total membrane protein was calculated. This expression level corresponds to approximately 0.3 mg of functional receptor per liter culture and it is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. Additionally, the binding affinity of the recombinant receptor for its endogenous ligand angiotensin II was found to be 1±0.1 nM, which is similar to that observed for the AT1aR in native tissues. More interestingly, the RC part of the fusion complex was structurally assembled in other words, properly folded as judged by the presence of the characteristic peaks at 760 nm, 800 nm and 850 nm by absorption spectroscopy. However, a slight change in the intensity of the peak at 800 nm was observed while comparing the spectra of native RC with that in the fusion protein complex. This slight variation might be due to the change in the protein environment. The fusion protein complex RC-AT1aR was functionally solubilized and purified using a decahistidine tag fused at the c-terminus of the AT1aR. Subsequently, the monodispersity and integrity of the complex was confirmed by size exclusion chromatography, which revealed a homogeneous peak. Additionally, it was also possible to solubilize and purify this complex in the presence of a fluorescein tagged angiotensin II ligand which provides a nice tool to judge the functionality of the AT1aR and integrity of the complex at the same time. The purified RC-AT1aR fusion complex was then subjected to three-dimensional (3-D) crystallization trials and it was possible to obtain reproducible crystals of this complex. The crystals were fluorescent (as the complex was purified in presence of fluorescently labelled angiotensin II) and needle or tetragonal in shape, but produced a powdery diffraction pattern. Further attempts to improve the crystallization condition and to optimize the cryo-conditions are underway. In addition, attempts are also being made to obtain the crystals of this complex with the antagonist (e.g. losartan) bound to the receptor. In view of several limitations in the heterologous expression of GPCRs, as the second part of my Ph.D. thesis, I decided to explore the possibilities of developing a novel expression system based on R. sphaeroides for production of recombinant GPCRs. The notion behind using this host is that lack of inclusion bodies and high concentration of membranes in R. sphaeroides would result in efficient functional overexpression of recombinant membrane proteins. For this purpose, a R. sphaeroides strain, modified by the deletion of the genes encoding the RC and the light harvesting proteins LH1 and LH2, was used. The genes for RC and LHs constitute about 85-90% of total membrane proteins in a R. sphaeroides cell. These membranes are normally housed in special membrane vesicles called intracytoplasmic membranes (ICMs) that can fill almost the entire cell volume under certain growth conditions. Synthesis of a heterologous protein under the control of the moderately strong photosynthetic superoperonic promoter should be coordinated with the synthesis of new membranes to harbour these proteins, thus acting as a natural induction system. Moreover, as most of the native membrane proteins are absent in this deletion strain, heterologously produced protein should not experience a shortage of molecular chaperones for proper folding and insertion. Additionally, the absence of inclusion bodies in this host should enhance the functional and homogenous population of the recombinant proteins. Three human GPCRs, namely the adenosine A2a receptor (A2a), the angiotensin II type 1a receptor (AT1aR) and the bradykinin subtype 2 receptor (B2R) were tested for expression and functionality in this system. Two different constructs were used to determine the optimal position and ribosome-binding site (RBS) in the superoperon for the highest expression level. Of these three receptors, the AT1aR and B2R were successfully produced, while the A2aR failed to express, producing green carotenoid free R. sphaeroides mutants, for unknown reasons. For the recombinant B2R, [3H] bradykinin binding analysis revealed a low functional expression level of 0.7-0.8 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to 0.01 mg functional receptor per liter of culture and is not sufficient for large-scale expression of this receptor. However, for the recombinant AT1aR, [125I] iodotyrosyl4Sar1Ile8- angiotensin II binding analysis revealed an expression level of 12±1 pmol/mg of total membrane protein. This expression level corresponds to approximately 0.1 mg functional receptor per liter culture and this is significantly higher than the AT1aR expression in native tissues. This expression system is still in the nascent stages of development and there are several parameters, which are still to be assessed for the optimal use of this system for the production of GPCRs and other membrane proteins. In conclusion, my Ph.D. work presents a novel fusion protein complex based approach for obtaining crystallizable GPCRs and a novel expression system for producing heterologous GPCRs. It was possible, for the first time, to produce a functional RC-GPCR complex that could easily be crystallized, though further finetuning of the system is required. R. sphaeroides based novel expression system was successfully used to produce functional human GPCRs under the control of a moderately strong photosynthetic superoperonic promoter. This expression system represents a naturally induced system where the expression of a heterologous protein is coordinated with the synthesis of new membranes to harbour the recombinant protein. The fusion protein complex approach and the expression system presented here can hopefully be used as a general method to facilitate the expression and crystallization of other membrane proteins.
• G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) steuern eine Vielzahl von Signalübertragungsprozessen durch die Zellmembran und stellen daher eine der bedeutendsten Membranproteinfamilien in Eukaryonten dar. Sie kodieren zum Beispiel in Vertebraten für 1-5% der Gene des gesamten Genoms und dienen aufgrund ihrer Schlüsselrolle in einer Reihe von zellulären und physiologischen Vorgängen als Zielprotein für etwa 50% aller Medikamente. Zur Entwicklung spezifischerer und wirksamerer gegen GPCRs gerichteter Medikamente wären hoch aufgelöste Raumstrukturen dieser Rezeptoren eine enorme Hilfe, vielleicht sogar essentiell. Trotzihrer immensen Bedeutung ist eine Strukturaufklärung eines GPCRs mit Ausnahme derjenigen des Rhodopsins bisher nicht gelungen. Das hat überwiegend zwei Gründe. Erstens können GPCRs nur in winzigen Mengen aus ihrem natürlichen biologischen Gewebe isoliert werden. Für eine Strukturanalyse werden jedoch Mengen im Milligrammbereich benötigt. Deshalb müssen GPCRs heterolog exprimiert werden, was nur selten möglich ist und noch seltener nach der Reinigung zu reinem und funktionell aktivem Protein in den geforderten Mengen führt. Zweitens ist ihre Kristallisation sehr schwierig, da GPCRs nur eine begrenzte hydrophile Oberfläche zur Ausbildung von Kristallkontakten zur Verfügung haben und gerade dort besonders flexibel sind. Insbesondere die N- und C-terminalen Segmente sowie die intra- und extrazellulären Schleifen müssen strukturell sehr variabel sein, um die zur Signalübertragung notwendigen Konformationsänderungen durchführen zu können. (Rhodopsin stellt insofern einen Sonderfall dar, als es aus seinem natürlichen Gewebe, der Rinderretina, isoliert werden konnte und für therapeutische Zwecke irrelevant ist.) Die vorliegende Doktorarbeit verfolgte zwei Ziele, denen ein völlig neuer Ansatz zur Überwindung der Schwierigkeiten bei der Expression und Kristallisation der GPCRs zugrundeliegt. Erstens sollten zwei GPCR-Modellgene mit einem photosynthetischen Reaktionszentrum (RC)-Gen von Rhodobacter sphaeroides fusioniert und anschließend im genannten Organismus exprimiert werden. Die diesem Ansatz zugrundeliegende Vorstellung war, dass das RC als eine Art Rahmen Kristallkontakte vermittelt und gleichzeitig die inhärente Flexiblität der GPCRs reduzieren könnte, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Zweitens sollte R. sphaeroides genetisch so verändert werden, dass dieser Organismus als universell verwendbares Expressionssystem für GPCRs eingesetzt werden kann. R. sphaeroides ist ein Gram-negatives, photosynthetisches Nicht-Schwefel-Purpurbakterium, das der α-Subgruppe der Proteobakterien zugeordnet wird. Das Bakterium hat einen sehr vielseitigen Metabolismus, wächst unter einer Reihe von Bedingungen and kann die Photosynthese, einen lithotrophen Stoffwechsel sowie die aerobe und anaerobe Atmung als Möglichkeiten zur Energiegewinnung nutzen. Während des photosynthetischen Wachstums synthetisiert der Organismus eine Reihe von photosynthetischen Membranproteinen wie das RC und die Lichtsammlerkomplexe I und II (LH1 und LH2), die einen Anteil von 85-90% der Gesamtproteinmenge in der Zellmembran ausmachen. Die photosynthetischen Membranproteine sind in spezifischen Membranstrukturen, den sogenannten intracytoplasmischen Membranen, eingebettet, die unter spezifischen Wachstumsbedingungen wie niedrigem Sauerstoffgehalt und niedriger Lichtintensität aus der Cytoplasma-Membran herauswachsen. Das RC aus R. sphaeroides ist strukturell gründlich untersucht. Es besteht aus drei Untereinheiten, wobei die L und M - Untereinheit jeweils fünf membranständige Helices und die H-Untereinheit eine Transmembranhelix aufweist. In das Helixgerüst sind 10 Kofaktoren eingebettet, die dem RC eine rot-braune Farbe verleihen. Es ist daher zu erwarten, dass der RC-GPCR - Komplex gleich gefärbt ist und folglich in Kristallisationsansätzen problemlos erkannt werden kann. Aufgrund von Modellierungsstudien mit den bekannten Strukturen des RC und des Rhodopsins wurden zwei Fusionskonstrukte ausgewählt. Im ersten Fusionsprotein wurde der GPCR zwischen die L- und M-Untereinheit eingebaut und sollte als eine Polypeptidkette exprimiert werden, die sich mit der H-Untereinheit zum Gesamtkomplex zusammenlagert. Das zweite Fusionsprotein wurde so konstruiert, dass der GPCR an das C-terminale Ende der M-Untereinheit angehängt wurde, so dass sich nach erfolgreicher Expression die M-GPCR , die L- und die H-Untereinheit zu einem Komplex zusammenlagern sollten. Um eventuell eine korrekte Faltung bzw. die Funktionsfähigkeit durch Variation der Länge herbeiführen zu können, wurden lange Verbindungsstücke mit geeigneten Schnittstellen zwischen den Untereinheiten des RC und des GPCRs eingeführt. Die veränderten Gene wurden in ein vom RK2-Plasmid abgeleitetes Plasmid kloniert und zur Expression in einen Deletionsstamm ohne chromosomales RC eingesetzt. Als Modellsysteme für GPCRs wurde der humane Endothelin-B-Rezeptor (ETbR) und der humane Angiotensin-1a-Rezeptor (AT1aR) ausgewählt. Obwohl die RC-GPCRs-Gene mit den unterschliedlichen Verbindungslängen zwischen RC und GPCR gemäß Western-Blot-Analysen exprimiert werden konnten, wurde eine Funktionsfähigkeit durch Ligandenbindung nur für AT1aR des Konstrukttyp M-GPCR nachgewiesen. Während der RC-ETbR-Komplex auf den Agonisten [125I] Endothelin-1 keine Bindungreaktion hervorrief, konnte mit dem der RC-AT1aR eine Bindung des Antagonisten [125I] Jodotyrosyl4Sar1Ile8-Angiotensin II eindeutig nachgewiesen werden. Unterschiedliche Verbindungslängen hatten keinen Einfluß auf diesen Befund. Dabei konnte RC-AT1aR-Komplex mit dem genannten Antigonisten vollständig gesättigt werden, woraus sich Werte für Bmax von 40 ± 5 pmol/mg und für Kd von 1 ± 0.1 nM ergaben. Der RC-AT1aR-Komplex konnte bis zu Mengen von etwa 0.3 mg Protein pro Liter Kultur exprimiert werden, was deutlich über den Werten in natürlichen Geweben liegt und für geplante Kristallisationsversuche ausreichen könnte. Ebenfalls von entscheidender Bedeutung für den Erfolg späterer Kristallisationsexperimente war die korrekte Faltung des RC. Es konnten die charakteristischen Absorptionsbanden bei 760 nm, 800 nm und 850 nm nachgewiesen werden, wenngleich die Bande bei 800 nm aufgrund der veränderten Proteinumgebung etwas verschoben ist. Das Fusionsprotein RC-AT1aR war in einer Anzahl von Detergenzien funktionell solubilisierbar. Dazu gehörten Tetradecylphoscholin (Fos14), Dimethyldodecylamin-NOxid (LDAO), Octyl-β-D-Glukosid (OG) und Dodecyl-β-D-Maltosid (βLM). Mit den genannten Detergenzien wurde eine Reinigung des Proteins mit Hilfe der Ni-NTA Affinitätschromatographiemethode in Angriff genommen, deren Anwendung ein am Cterminalen Ende angehängtes Decahistidin-Tag ermöglichte. Reiner Rezeptor konnte mit den Detergenzien Fos14 und βLM erhalten werden. Der Reinheitsnachweis erfolgte mittels einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese-Methode. Die Homogenität und Integrität des Komplexes wurde mit Hilfe der Gelfiltrations-Methode untersucht, wobei nur eine Bande für den RC-AT1aR-Komplex erhalten wurde, die sich laut SDSPolyacrylamidgelelektrophorese- Gel aus dem M-AT1aR, der L und der H-Untereinheit zusammensetzt. Detergenzaustausche erwiesen sich nicht als erfolgversprechend, da in diesem Fall die L und H-Untereinheiten abgespalten wurden. Es gelang ebenfalls den RC-AT1aR-Komplex in Gegenwart des mit Fluoreszein verknüpften Angiotensin II-Liganden zu solubilisieren und zu reinigen. Der Zusammenhalt des Komplexes wurde mit Hilfe der Gelfiltrationsmethode verifiziert. Dieser Komplex wurde für Kristallisationsversuche verwendet und dabei zunächst Bedingungen getestet, die für das RC aus R. sphaeroides erfolgreich waren. In der Tat konnten reproduzierbar Kristalle gezüchtet werden, die fluoreszierten, eine tetragonale Form aufwiesen und Diffraktionsmuster lieferten, die Pulverbeugungsbildern entsprachen. Kristalle wurden auch mit Ammoniumsulfat als Fällungsmittel erhalten, aber aus Zeitgründen nicht näher untersucht. Ferner wurden Kristallisationsversuche zwischen dem Komplex aus RC-AT1aR und dem Antagonist Losartan unternommen, die aber bis jetzt erfolglos blieben. Aufgrund der bekannten Probleme, GPCRs heterolog herzustellen, und aufgrund der beschriebenen Erfolge, entschlossen wir uns, die Möglichkeit genauer zu untersuchen, R. sphaeroides als Expressionssystem für GPCRs zu verwenden. Die Abwesenheit von „Inclusion bodies“ und die Anwesenheit ausreichender Membranvolumina sind bereits günstige Startvoraussetzungen, um rekombinante Membranproteine funktionell herzustellen. Zusätzliche Verbesserungen wurden dadurch erreicht, dass ein R. sphaeroides Stamm verwendet wurde, bei dem Gene, die für das RC und die Lichtsammler LH1 und LH2 kodieren und 85-90% der gesamten Proteine der Zellmembran ausmachen, (teilweise) herausgeschnitten worden waren. Die Synthese von heterologen GPCRs wurde unter die Kontrolle des gemäßigten photosynthetischen superoperonischen Promotor gestellt und ist somit an die Synthese neuer Membranen gekoppelt. Da, wie erwähnt, die Gene der photosynthetischen Membranproteine nicht vorhanden waren, erniedrigt sich die Proteindichte in der Zelle bzw. sollten pro Protein mehr Chaperonmoleküle zur Verfügung stehen und damit die Faltungschancen erhöhen. Drei humane GPCRs - der Adenosin A2a-Rezeptor (a2A), der Angiotensin II 1a - Rezeptor (AT1aR) und der Bradykinin Subtyp-2-Rezeptor (B2R) - wurden bezüglich Expression und Funktionalität getestet. Intessanterweise zeigte sich, dass die teilweise Anwesenheit der RC- und der Lichtsammlergene die Expression der GPCRs aus unbekannten Gründen verstärken. Die beste Expression wurde erhalten, wenn das GPCRGen hinter dem pufM-Gen (kodiert für Untereinheit M) im pRKEH10D-Plasmid (ein Abkömmlung des RK2-Plasmids ) und vor einem puf Operons liegt, nachdem zuvor die für LH1 kodierende Gene entfernt wurden. Von den drei ausgewählten Rezeptoren konnten nun der Angiotensin II Typ1A-Rezeptor und der Bradykinin Subtyp 2-Rezeptor nicht aber der Adenosin A2a-Rezeptor exprimiert werden. Die Versuche mit dem letztgenannten Rezeptor lieferten überraschenderweise eine grünliche, Carotenoid-freie Mutante. [3H] Bradykinin-Bindungsstudien ergaben für den rekombinanten hHB2R eine niedrige Expression von 0.7-0.8 pmol/mg, was einer Menge von etwa 0.01 mg an funktionellem Rezeptor pro 1 Liter Kultur entspricht. Rekombinanter AT1aR konnte mit [125I]-Jodotyrosyl4Sar1Ile8-Angiotensin II gesättigt werden (und hatte nur eine Bindungsstelle). Aus der Sättigungskurve ergab sich ein Bmax -Wert von 12 ± 1 pmol/mg und ein Kd-Wert von 1 ± 0.1 nM, was vergleichbar ist zu den Werten, die in natürlichen Geweben gemessen wurden. Mit einem Wert von etwa 0.1 mg funktionalem Rezeptor pro Liter Kultur ist die Expression des AT1aR deutlich höher als in natürlichen Geweben. Interessanterweise ist die Morphologie der R. sphaeroides - Zellen, die den Rezeptor exprimieren, und ihre intrazelluläre Membranarchitektur signifikant verschieden zu derjenigen von Zellen, die keinen Rezeptor exprimieren. Die Entwicklung von R. sphaeroides als Expressionssystem steht erst am Anfang und es gibt mehrere Parameter, die noch verändert werden können, um ein optimales System zur Produktion von GPCRs und anderen Membranproteinen zu erhalten. Dazu gehört die Entwicklung von Protease freien Stämmen und von schnelleren Transformationsmethoden für den Gentransfer anstelle der langwierigen Konjugationsmethode. Ferner kommt das pRKEH10D Plasmid, ein Abkömmling des pRK404-Plasmids nur in wenigen Kopien in R. sphaeroides vor und es wäre vorteilhaft, mit einem Plasmid mit hoher Kopienzahl zu arbeiten. Schließlich üben Affinitäts-“tags“ häufig einen maßgeblichen Einfluss auf die Expression von Fremdproteinen aus. Daher erscheinen weitere Untersuchungen in dieser Richtung ebenfalls als lohnend. Zusammenfassend stellte diese Doktorarbeit einen neuartigen Ansatz dar, kristallisationsfähige GPCRs zu erhalten. Es war möglich, einen RC-GPCR-Fusionskomplex rein, funktionell und in größeren Mengen darzustellen und diesen in Komplex mit fluoreszierendem Angiotensin II bei den bekannten Kristallisationsbedingungen des RC ohne GPCR zu kristallisieren. Auch die Expression eines GPCR ohne Fusion mit einem anderen Protein mit Hilfe eines genetisch veränderten Rb. sphaeroides Stamms gelang. Wir sind daher überzeugt, dass nun auch andere GPCRs und Membranproteine erfolgreich rekombinant in Rb. sphaeroides hergestellt werden können.