Open Access

Sarika Shastri

• Proteorhodopsin (PR) originally isolated from uncultivated γ-Proteobacterium as a result of biodiversity screens, is highly abundant ocean wide. PR, a Type I retinal binding protein with 26% sequence identity, is a bacterial homologue of Bacteriorhodopsin (BR). The members within this family share about 78% of sequence identity and display a 40 nm difference in the absorption spectra. This property of the PR family members provides an excellent model system for understanding the mechanism of spectral tuning. Functionally PR is a photoactive proton pump and is suggested to exhibit a pH dependent vectorality of proton transfer. This raises questions about its potential role as pH dependent regulator. The abundance of PR in huge numbers within the cell, its widespread distribution ocean wide at different depths hints towards the involvement of PR in utilization of solar energy, energy metabolism and carbon recycling in the Sea. Contrary to BR, which is known to be a natural 2D crystal, no such information is available for PR til date. Neither its functional mechanism nor its 3D structure has been resolved so far. This PhD project is an attempt to gain a deeper insight so as to understand structural and functional characterization of PR. The approach combines the potentials of 2D crystallography, Atomic Force Microscopy and Solid State NMR techniques for characterization of this protein. Wide range of crystalline conditions was obtained as a result of 2D crystallization screens. This hints towards dominant protein protein interactions. Considering the high number of PR molecules reported per cell, it is likely that driven by such interactions, the protein has a native dense packing in the environment. The projection map represented low resolution of these crystals but suggested a donut shape oligomeric arrangement of protein in a hexagonal lattice with unit cell size of 87Å*87Å. Preliminary FTIR measurements indicated that the crystalline environment does not obstruct the photocycle of PR and K as well as M intermediate states could be identified. Single molecule force spectroscopy and atomic force microscopy on these 2D crystals was used to probe further information about the oligomeric state and nature of unfolding. The data revealed that protein predominantly exists as hexamers in crystalline as well as densely reconstituted regions but a small percentage of pentamers is also observed. The unfolding mechanism was similar to the other relatively well-characterized members of rhodopsin family. A good correlation of the atomic force microscopy and the electron microscopy data was achieved. Solid State NMR of the isotopically labeled 2D crystalline preparations using uniformly and selectively labeling schemes, allowed to obtain high quality SSNMR spectra with typical 15N line width in the range of 0.6-1.2 ppm. The measured 15N chemical shift value of the Schiff base in the 2D crystalline form was observed to be similar to the Schiff base chemical shift values for the functionally active reconstituted samples. This provides an indirect evidence for the active functionality of the protein and hence the folding. The first 15N assignment has been achieved for the Tryptophan with the help of Rotational Echo Double Resonance experiments. The 2D Cross Polarization Lee Goldberg measurements reflect the dynamic state of the protein inspite of restricted mobility in the crystalline state. The behavior of lipids as measured by 31P from the lipid head group showed that the lipids are not tightly bound to the protein but behave more like the lipid bilayer. The 13C-13C homonulear correlation experiments with optimized mixing time based on build up curve analysis, suggest that it is possible to observe individual resonances as seen in case of glutamic acid. The signal to noise was good enough to record a decent spectrum in a feasible period. The selective unlabeling is an efficient method for reduction in the spectral overlap. However, more efficient labeling schemes are required for further characterization. The present spectral resolution is good for individual amino acid investigation but for uniformly labeled samples, further improvement is required.
• Proteorhodopsin (PR) wurde ursprünglich aus nicht kultivierten γ-Proteobakterium isoliert und ist in großen Mengen in den Ozeanen enthalten. PR ist wie sein homolog Bakteriorhodopsin (BR) ein TypI Retinal Bindeprotein und die Sequenzen sind zu 26% identisch. Innerhalb der PR Familie haben die Mitglieder eine Sequenzhomologie zu ungefähr 78% und zeigen einen Unterschied von 40 nm im absorptions spektrum. Diese Eigenschaft bietet ein gutes Modelsystem um zu verstehen durch welchen Mechanismus das Absorptionsspektrum moduliert wird. PR ist ein photoaktive Protonenpumpe und es wird angenommen, dass die Richtung des Protonentransfers vom pH-wert abhängt, was auf eine Rolle als ein pH abhängiger Regulator hindeutet. Da PR sowohl in der Zelle in hoher Zahl, als auch in den Ozeanen in unterschiedlichen Tiefen weit verbreitet ist, wird angenommen, dass PR bei der Verwertung von Sonnenlicht, im Energiestoffwechsel und beim Kohlenstoffumsatz beteiligt ist. Im Gegensatz zu BR, welches bekannterweise 2D Kristalle bildet, ist etwas vergleichbares für PR bis heute nicht bekannt. Weder der Mechanismus von PR noch seine 3D Struktur sind bisher gelöst. Die vorliegende Doktorarbeit versucht offene Punkte zum Mechanismus und zur Struktur von PR zu klären. Für die Charakterisierung werden 2D Kristallographie, "Atomic Force Microscopy" und Festkörper NMR verwendet. Für die Bildung von 2D Kristallen konnte eine große Auswahl an Kristallisationbedingungen ermittelt werden, was auf deutliche Protein Protein Wechselwirkungen hindeutet. Zieht man die hohe Zahl an PR Molekülen pro zelle in betracht, ist es wahrscheinlich, dass durch diese Interaktionen auch in der natürlichen Membran eine dichte Packung der Proteine auftritt. Elektronenmikroskopische Aufnahmen mit geringer Auflösung deuten auf eine ringförmige Anordnung der Proteine in einem hexagonalen Gitter mit einer Einheitszelle von 87Å * 87Å. Vorläufige FTIR Messungen deuten darauf hin, dass diese Anordnung den Photozyklus nicht behindert und sowohl K als auch M Zustand konnten identifiziert werden. Um weitere Informationen über den Oligomerisierungszustand der 2D Kristalle zu gewinnen wurden Einzelmolekül - und Rasterkraft Mikroskopie durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass das Protein in kristallinen und dicht rekonstituierten Regionen überwiegend als Hexamer vorliegt. Daneben kann zu einem geringen Anteil auch ein pentamerer Zustand beobachtet werden. Der Mechanismus der Proteinentfaltung war vergleichbar zu anderen, besser untersuchten Mitgliedern der Rhodopsinfamilie. Zwischen den Daten aus der "Atomic Force Microscopy" und der Elektronenmikroskopie zeigt sich eine gute Korrelation. Festkörper NMR an vollständig und selektiv markierten 2D Kristallen ergaben Spektren mit einer typischen 15N Linienbreite von 0,6 bis 1,2 ppm. Die 15N chemische Verschiebung der Schiffschen Base hat im Kristall den gleichen Wert wie funktional aktiv rekonstitutierte Proben, was indirekt die Funktionalität und die korrekte Faltung bestätigt. Die Zuordnung der 15N Signale für Tryptophan wurde durch "Rotational Echo Double Resonance" Experimente vorgenommen. 2D kreuzpolarisation Lee Goldburg Messungen zeigen den dynamischen Zustand des Proteins trotz der eingeschränkten Mobilität im kristallinen Zustand. Das Verhalten der Lipide wurde mit 31P messungen der Lipidkopfgruppe untersucht und zeigt, dass diese nicht fest gebunden sind, sondern sich mehr wie in einer Lipiddoppelschicht verhalten. Für 13C-13C homonukleare korrelations Experimente wurde die Mischzeit durch die Analyse von Aufbaukurven optimiert. Diese Versuche deuten darauf hin, dass es möglich ist einzelne Resonanzen aufzulösen, wie im Fall des Glutamat gezeigt mit einem gutem Signal zu Rauschen Verhältnis. Selektives "unlabeling" ist eine effizente Methode um die Ueberlappung der Signal zu reduzieren. Darüberhinaus sind für eine weitere Chrakterisisierung effizentere Markierungsschemata notwendig. Die bisherige spektrale Auflösung ist gut genug für die Untersuchung einzelner Aminosäuren, für vollständig markierte Proben sind weitere Verbesserungen notwendig.