Role of PrPC in neuronal differentiation and propagation of its infectious isoform PrPSc by microvesicles

Die Rolle von PrPC in der neuronalen Differenzierung und die Ausbreitung der infektiösen Isoform PrPSc durch Mikrovesikel

  • Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare neurological disorders that may be of genetic or infectious origin, but most frequently occur sporadically in humans. Their outcome is invariably fatal. The infectious agent has been defined as prion (from proteinaceous infectious only) in 1992 by Stanley B. Prusiner and represent mainly, if not solely, an abnormal, protease-resistant isoform (PrPSc) of a cellular protein, the prion protein or PrPC. According to the “protein only” hypothesis, the prion is devoid of informational nucleic acids and consists of an “infectious” protein that is capable of converting the normal host protein PrPC into a likeness of itself. TSEs can be distinguished from other neurodegenerative diseases because of their infectivity and transmission capability. The only organ system in which severe histopathological damage can be demonstrated as a consequence of infection with prions is the nervous system. The communal lesions are neuronal loss, spongiosis and astrogliosis, accompanied by an intra- and extracellular accumulation of PrPSc, occasionally in form of amyloid plaques. Even if a strong activation of microglia and astrocytes occurs, no immunological response is usually detectable as consequence of prion infection. Despite the considerable attention for its involvement in TSEs, the physiological role of the cellular, nonpathogenic isoform of PrPC, has not yet been determined. In the last years, several putative cellular functions have been attributed to PrPC: its localization in “lipid rafts” is consistent with a possible role in cell adhesion, transmembrane signalling or as a recognition molecule. Furthermore, PrPC has been implicated in protection against oxidative stress, copper metabolism, apoptosis, cell proliferation and in the regeneration of blood precursors stem cells in the adult. It has also been shown that PrPC interacts with the neuronal cell adhesion molecule NCAM, promoting neurite outgrowth. However, both the PrPC-mediated effects and the role of PrPC-dependent pathways on neuronal differentiation are still not elucidated. First objective of this Ph.D thesis was the establishment of a novel in vitro cellular model for the study of the role of PrPC in neuronal differentiation and neurite outgrowth. Furthermore, an additional goal of this project was the indentification of the PrPC domains responsible for the induction of neuronal differentiation. A novel PrPC-depleted cell line (PrP0/0 ML) was derived from murine primary PrP-knockout neuronal cells by SV40 large T antigen-mediated immortalization. A temperature sensitive form of this oncogenic protein was used, allowing a temperature-mediated regulation of its expression. This cell line was then characterised for its growth potential, for the expression of specific cellular markers and for its ability to differentiate. It was found that, under culture conditions promoting the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen, the cells expressed nestin, a specific marker of neuronal precursor cells. Therefore, the PrP0/0 ML cell line was identified as a potential neuronal stem cell line. In fact, under nonpermissive culture conditions when the expression of the temperature-sensitive SV40 large T antigen is downregulated, the PrP0/0 ML cells differentiated into neurons. Noteworthy, maintenance of the cells in conditions that promote cell differentiation induced a progressive reduction in the expression levels of nestin, an event that strongly correlated with the appearance of the specific neuronal markers MAP-2b and NeuN. In order to investigate the role of PrPC in the process of neuronal differentiation, the PrP0/0 ML cells were then reconstituted for the expression of either the full-length PrP or a N-terminal truncated PrPC form (PrPdel32-134). The differentiation potential of both reconstituted cell lines under nonpermissive culture conditions was then compared with that of the parenteral PrP0/0 ML cells. This in vitro study clearly highlights that PrPC expression in the PrP0/0 ML cell line accelerates neuronal differentiation and that the N-terminal domain of the prion protein is not necessary for this PrP-mediated function. Prion diseases like BSE, vCJK, Kuru and the majority of iatrogenic cases of CJK are caused by a peripheral infection. Infectious prions accumulate in the central and peripheral nervous system as well as in extracerebral tissues, such as the secondary lymphoid organs and muscles. The prion pathogenesis is a dynamic process which can be defined temporary and spatially in different phases: i) infection and peripheral replication, ii) neuroinvasion, transport of prions from the periphery to the central nervous system (CNS), and iii) neurodegeneration. In the last years, progresses in the elucidation of the peripheral prion pathogenesis were achieved. The identification of the cell types involved in the lymphoreticular prion replication phase and the recognition of the role of the peripheral nervous system in the process of prion spread from the periphery to the CNS have elucidated some of the cellular mechanisms that are involved in prion uptake, replication and propagation. However, relatively little information is available about the mechanism(s) underlying intercellular prion transfer and tissue-to tissue prion spread. Microvesicles (MVs) are submicron vesicles (0,03-1 microm.) with a single membrane and are shed from most eukaryotic cells undergoing activation or apoptosis. The segregation of specific proteins is followed by blebbing of the membrane surface, leading to the formation of MVs and their release in the extracellular environment. MVs can be also secreted upon fusion of multivesicular endosomes with the plasma membrane (exosomes). The secretion of MVs is the result of a complex cellular process involving changes in the metabolism of lipids and proteins. The functional role of MVs is still largely unknown. However, there is evidence showing that they are important modulators of cell-to-cell communication, participate in a variety of intracellular adhesion processes and are able to induce cellular response(s). The release of PrPC and infectious PrPSc by prion infected epithelial, neuroglial and neuronal cells in association with exosomes has recently been highlighted. Furthermore, it has been shown that exosomes can propagate prion infectivity both in vitro and in vivo, suggesting that PrPSc-bearing exosomes may provide a mechanism for intercellular transmission of infectious prions in addition to cell-to-cell contact. Second objective of this Ph.D thesis was to determine the possible role of plasma membrane-derived microvesicles in the propagation and transmission of prions. The release of MVs was first studied in different murine neuronal cell lines. Here it is shown for the first time that neurons also shed plasma membrane derived MVs, in addition to exosomes. Immunoelectron microscopy and immunoblot analyses clearly demonstrated the presence of PrPC on the membrane of MVs released from PrPC-expressing cells. Characterization of lipid rafts components in MVs highlighted the presence of the ganglioside GM2, the tyrosine kinase p59Fyn, flotillin-2 and the neuronal protein GAP-43. In order to investigate whether MVs are involved in the intercellular transmission of prions, MVs were first isolated from two prion infected murine neuronal cell lines, namely the Neuro-2a PK1 and the N2a58 cells, and then used for in vitro and in vivo infection assays. Immunoblot analyses after proteinase K treatment demonstrated the association of PrPSc with the secreted MVs. The PrPSc-bearing MVs were then used to perform infection experiments on noninfected cells. By the use of cell blot assay, a method that allows the detection of PrPSc-amplification and -accumulation in cultured cells, the kinetic of prion infection in the de novo infected cells was followed. Noteworthy, it was found that PrPSc-bearing MVs were capable to transmit prions in vitro and to stably infect the recipient cells. In order to investigate the role of MVs in the transmission of infectivity in vivo, PrPSc-bearing MVs as well as MVs isolated from noninfected cells (as negative control) were injected intracerebrally in PrPC-overexpressing indicator mice (tga20). The development of clinical disease was followed in a time-dependent manner. Clinical symptoms could be observed only in the group of indicator mice inoculated with the PrPSc-bearing MVs, which then succumbed to desease. These findings clearly demonstrated that MVs are biological carriers of both PrPSc and prion infectivity. MVs could therefore participate in vivo in the processes of intercellular prion transmission and propagation.
  • Die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs) oder Prionenerkrankungen bilden eine Gruppe fataler neurodegenerativer Erkrankungen, welche einen weiten Wirtsbereich (Mensch und Tier) aufweisen. Sie treten in vererbbarer, sporadischer sowie infektiöser Form auf. Der infektiöse Erreger wurde als „Prion“ (proteinaceous infectious only) in 1992 von Stanley B. Prusiner gennant und ist auf die enge Korrelation von Infektiösität und PrPSc , einer partiell Protease-resistenten Isoform (Scrapie-Isoform) des zellulären, physiologischen Prion Protein (PrPC), zurückzuführen. Gemäss der „protein only“ Hypothese bezeichnen Prionen infektiöse Einheiten, welche sich durch das Fehlen einer Erbinformation von konventionellen Erregern unterscheiden und in der Lage sind, das normale endogene PrPC in der infektiöse Form umzuwandeln. TSEs unterscheiden sich von anderen neurogenerativen Erkrankungen durch Ihre Infektiosität und Übertragbarkeit. Prionen verursachen im Gehirn einen herdförmigen Neuronenzelluntergang, spongiforme Veränderungen des Nervengeflechts (Neuropil), Astrozytenvermehrung (Astrozytose) und charakteristische intra- und extrazelluläre PrPSc-Ablagerungen. Außer einer mitunter massiven Mikroglia- und Astrozytenaktivierung sind üblicherweise keine zellulären immunologischen Reaktionen erkennbar. Die Funktion des zellulären, nicht pathogenen PrPC ist trotz intensiven Anstrebungen während der letzten Jahre noch nicht eindeutig identifiziert worden. Verschiedene putative Funktionen wurden zu PrPC zugeschrieben: die Lokalisierung von PrPC in „lipid rafts“ lässt eine Rolle in der Zelladhäsion, in der transmembranären Signalkaskaden sowie als Ligand/Rezeptor vermuten. Es wurde weiterhin gezeigt, dass PrPC in der Regulierung von oxidativem Stress, in dem Kupfer-Stoffwechsel, in der Apoptose, in der Regenerierung von adulten blutbildenden Stammzellen und in der Regulierung der Zellvermehrung involviert ist. Die nachgewiesene Interaktion von PrPC mit dem zellmembranären Protein NCAM (neuronal cell adhesion molecule) hat zur Postulierung geführt, dass PrPC in der neuronalen Differenzierung eine wesentliche Rolle spielt. Die PrPC-abhängigen zellulären Mechanismen, die in der Induktion der neuronalen Differenzierung involviert sind, sind bis heutzutage noch nicht vollständig aufgeklärt. Erstes Ziel dieser Dissertation war, ein neues zelluläres Modell für die Untersuchung der Rolle von PrPC in der neuronalen Differenzierung zu etablieren. Dieses neue in vitro Modell wurde dann verwendet, um die PrPC-bedingten Einflüsse auf diesen Prozess zu charakterisieren. Die Identifizierung der Domäne des Prionproteins, die für die Induktion der neuronalen Differenzierung notwendig sind, war ein zusätzliches Ziel dieses ersten Projektes. Um diese biologische Fragenstellungen experimentell zu bearbeiten, wurde erstens eine neue PrP-depletierte Zelllinie (PrP0/0 ML) durch SV40-Large T Antigen-bedingte Immortalisierung aus murinen primären PrP-knockout neuronalen Zellen generiert. Die biologischen Eigenschaften dieser Zelllinie wurden dann vollständig charakterisiert: Wachstum, Expression von spezifischen zellulären Antigenen und Differenzierung wurden untersucht. Es stellte sich heraus, dass unter Kulturbedingungen, bei welcher die temperatursensitive Form des SV40-Large T Antigen exprimiert wird, die PrP0/0 ML Zellen die Expression des Antigens Nestin vorwiesen. Da Nestin ein zellulärer Marker ist, der spezifisch in neuronalen Vorläuferzellen vorkommt, wurden die PrP0/0 ML Zellen als potenziellen neuronalen Stammzellen identifiziert. Unter nicht permissive Kulturbedingungen, differenzierten sich die PrP0/0 ML Zellen ausschliesslich zur Neuronen. Es wurde in der Tat nachgewiesen, dass in einem zeitabhängigen Prozess die Unterregulierung von Nestin der Hochregulierung der spezifischen neuronalen Markern Map-2b und NeuN vorausgeht. Um die Rolle des Prionproteins in der neuronalen Differenzierung zu untersuchen, wurden dann die PrP0/0 ML Zellen für die Expression entweder von „wild Type“ PrPC oder von einer N-terminalen trunkierten Form von PrPC (PrPdel32-134) rekonstituiert. Der Prozess der Differenzierung der beiden rekonstituirten Zelllinien wurde mit jenem der PrP0/0 ML Zellen verglichen. Die durchgeführten Experimente zeigten eindeutig, dass die Expression von PrPC in der PrP0/0 ML Zelllinie die neuronale Differenzierung beschleunigt und dass der N-Terminus des Prionproteins für diese Funktion nicht notwendig ist. Prionenerkrankungen, wie BSE, vCJK, Kuru und die meisten Fälle von iatrogener CJK, entstehen normalerweise durch eine peripherale Infektion. Infektiöse Prionen akkumulieren sich nicht nur innerhalb des zentralen und peripheren Nervensystems aber auch in extrazerebralen Geweben, wie in den sekundären lymphatischen Organen und in den Muskeln. Die Pathogenese der Prionerkrankung ist ein dynamischer Prozess, den man in sowohl zeitlich als auch räumlich getrennten Phasen unterteilen kann: i) Infektion und periphere Replikation, ii) Neuroinvasion, der Transport von Prionen von der Peripherie zum Zentralnervensystem, und iii) Neurodegenerierung. In den letzen Jahren wurden grosse Vorschritte in der Aufklärung der periphere Pathogenese erzielt. Die Identifizierung von den Zellen, welche die Prion-Propagation im lymphoretikulären System unterstützen, und die Erkenntnisse über die wichtige Rolle des peripheren Nervensystems bei der Ausbreitung von Prionen von der Peripherie ins Zentralnervensystem haben einige der zellulären Mechanismen aufgeklärt, die bei der Prionen-Aufnahme, -Replikation und –Ausbreitung beteiligt sind. Die molekularen Mechanismen der Prionenübertragung von Zelle zu Zelle und von Gewebe zu Gewebe sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Mikrovesikel (MVs) sind submikroskopische (0,03-1 mikrom. in Durchmesser) Vesikel, die von einer einfachen Membran umgeben sind und von eukaryotischen Zellen nach Aktivierung oder während der Apoptose freigesetzt werden. Mikrovesikel werden sowohl von der Plasmamembran als auch nach der Verschmelzung von multivesikulären Endosomen mit der Plasma Membran (Exosomen) sezerniert. Die Freisetzung der Mikrovesikel ist das Resultat eines sehr komplexen zellulären Vorgangs, der unter anderem Veränderungen in dem Metabolismus sowohl von Lipiden als auch von Proteinen beinhaltet. Die biologischen Funktionen von freigesetzten MVs sind heutzutage noch nicht aufgeklärt worden. Es wurde postuliert, dass MVs wichtige Modulatoren für die Kommunikation zwischen Zellen sein könnten. MVs spielen auch eine Rolle in verschiedenen intrazellulären Adhäsionsprozessen und in der Induktion zellulärer Antworten. Es wurde schon gezeigt, dass mit Prionen infizierten Zellen PrPSc und Prionen-Infektiösität in Assoziation mit Exosomen freisetzen. Zusätzlich hat man nachgewiesen, dass solche Exosomen in der Lage sind, Prionenerkrankungen sowohl in vitro als auch in vivo zu übertragen. Diese Befunde führten zur Hypothese, dass Vesikel für die Übertragung und Verbreitung von Prionen verantwortlich sein könnten. Zweites Ziel dieser Dissertation war, die Rolle von Plasmamembran-stammende Mikrovesikel in der Ausbreitung und Übertragung von Prionen festzustellen. Die Freisetzung von MVs wurde zuerst in verschiedenen neuronalen murinen Zelllinien untersucht. Es wurde für das erste Mal gezeigt, dass Neuronen, zusätzlich zur Exosomen, auch Mikrovesikel sezernieren. Immunoelektronenmikroskopische- und Immunoblot-Analysen von isolierten MVs haben eindeutig nachgewiesen, dass PrPC einen Bestandteil von MVs ist. Die Charakterisierung von „lipid rafts“ Komponenten hat ergeben, dass in MVs das Gangliosid GM2, die Tyrosinkinase p59Fyn, flotillin-2 und das neuronale Protein GAP-43 vorhanden sind. Um die Involvierung von den MVs in der interzelluläre Übertragung von Prionen nachzuweisen, wurden MVs aus zwei unterschiedlichen stabil infizierten murinen neuronalen Zelllinien, die Neuro-2a PK1 und die N2a 58, isoliert und für de novo in vitro und in vivo Infektionsexperimenten verwendet. Immunoblot Analysen nach Proteinase K Behandlung haben gezeigt, dass PrPSc mit den freigesetzten MVs assoziiert ist. Die PrPSc-tragenden MVs wurden in den daran folgenden Experimenten zur Infektion von uninfizierten Zellen angesetzt. Mittels „cell blot assay“, ein Verfahren dass den Nachweis von PrPSc-Amplifikation und -Akkumulierung in kultivierten Zellen ermöglicht, wurde der Verlauf der in vitro Prioneninfektion verfolgt. Man hat eindeutig gezeigt, dass PrPSc-tragenden MVs für die Übertragung von Prionen und für eine stabile Prioneninfektion in vitro der Empfängerzellen verantwortlich sind. Um die in vivo MV-bedingte Prionenübertragung zu untersuchen, wurden PrPSc-tragenden MVs und MVs gewonnen aus nicht infizierten Zellen (als negativ Kontrolle) in PrPC überexprimierenden Mäusen (tga20) intrazerebral inokuliert. Die Entwicklung einer klinischen manifestierenden Prionerkrankung wurde in diesem „Bioassy” zeitlich verfolgt. Ausschliesslich Indikator Mäuse, die mit PrPSc-tragenden MVs inokuliert wurden, entwickelte die Erkrankung. Diese Ergebnisse zeigten eindeutig, dass MVs biologische Trägern von PrPSc und Infektiösität sind. MVs könnten deswegen in vivo in der Prozesse der interzellulären Prionen-Ausbreitung und -Übertragung beteiligt sein.

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Author:Maria Grazia Barenco Montrasio
Referee:Jürgen Bereiter-HahnORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2008/10/31
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2008/09/08
Release Date:2008/10/31
Tag:Infektiösität; Mikrovesikel; Neuronale Differenzierung; PrP
Infectivity; Microvesicles; Neuronal Differentiation; PrP; Prion
GND Keyword:Nervenzelle; Zelldifferenzierung; Prion; Prionprotein; Vesikel; Übertragbarkeit; Ausbreitung
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht