Open Access

Thi Trinh Nguyen

• Als chronisch entzündliche systemische Erkrankung mit dominanter Manifestation an den Gelenken kann die rheumatoide Arthritis in ihrem progredienten Verlauf mit den derzeit existierenden krankheitsmodifizierenden Antirheumatika oft nicht vollständig aufgealten werden. Dies hat irreversible Knorpeldestruktion und Knochenusuren mit schwerwiegenden Einbußen der Gelenkfunktion zur Folge. In der Literatur gibt es überzeugende Hinweise auf eine wichtige Rolle der T-Zellen in der Immunpathogenese der RA, die neben verschiedenen Mechanismen der erworbenen Immunität auch matrixdegradierende Prozesse der fibroblastenartigen Synoviozyten (FLS) propagieren. Die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine aus Makrophagen wie IL-1β, TNF-α und IL-18 führt wiederum zur Induktion der ebenfalls entzündungsfördernden T-Zell-Zytokine IL-2 und IFN-γ. Die Bedeutung von IL-17, einem anderen T-Zellzytokin, war zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Arbeit noch nicht verstanden, und IL-23 war noch nicht entdeckt. In der vorliegenden Arbeit wurden periphere mononukleäre Zellen (PBMC) aus dem Venenblut (systemische Komponente) und der Synovialflüssigkeit (SFMC, lokale Komponente) von RA und Kontroll-Patienten (andere Formen der Arthritis) mittels Ficoll-Gradient Dichtezentrifugation separiert und die Subpopulationen von T-Zellen durch fluoreszierende Antikörper gegen die Oberflächenmerkmale CD4, CD8, CD45RA und CD45RO mittels FACS-Analyse identifiziert, um ihr Verteilungsmuster in den systemischen und lokalen Kompartimenten zu erfassen. Außerdem wurden T- Zellen bezüglich ihres Aktivierungsstatus durch Markierung mit anti-CD69-Antikörpern und das intrazelluläre Zytokinexpressionmuster (IL-2, IFN-γ, IL-10) nach Sekretionshemmung durch Monensin und anschließender Permeabilisierung der Zellen mittels Saponin auf Einzelzellniveau untersucht. Der Einfluss von autologen und allogenen FLS auf die T-Zellen hinsichtlich der oben genannten Aktivierungsparameter (CD69 und Zytokinexpression) wurde zudem in vitro an einem autologen und allogenen Kultur-System durch Koinkubation von peripheren mononukleären Zellen mit FLS von RA Patienten untersucht. Hierbei kamen FLS, die aus der Synovialmembran und aus der Synovialflüssigkeit gewonnen wurden, nach der 4. bis 5. Passage in der Langzeitkultur zum Einsatz. Eine präferentielle Akkumulation von CD45RO+ Memory T-Zellen wurde ex vivo sowohl in den Subpopulationen von CD4+ als auch CD8+ T Zellen in allen untersuchten Synovialflüssigkeiten unabhängig von der Arthritisform bzw. Grundkrankheit festgestellt. Außerdem zeigte sich sowohl bei RA- als auch bei Kontrollpatienten mit anderen Arthritisformen sowohl in den CD45RA+ naiven als auch CD45RO+ Memory CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Synovialis im Vergleich zum Blut eine erhöhte CD69 Expression als Ausdruck eines frühen Aktivierungszustandes. Trotzdem konnte nur bei einem geringen Anteil dieser T-Zellen die Expression von IL-2 detektiert werden. Dies zeigt eine präferentielle Rekrutierung einwandernder Memory T-Helfer- und –Suppressorzellen ins Gelenk, aber eine zumeist inkomplette Aktivierung sowohl von naiven als auch von Memory T-Zellen bei RA- und Kontrollpatienten. Die Patienten mit RA und anderen Arthritisformen unterschieden sich jedoch hinsichtlich der Expression von IL-10, einem entzündungshemmenden Zytokin, und IFN-γ in den PB- und SF-T-Zellen. Hier schien vor allem die Subpopulation von CD8+ T-Zellen einen relevanten Beitrag zur gesteigerten IL-10-Expression zu leisten. Entsprechend konnte im Koinkubationsexperiment demonstriert werden, dass nur die CD8+ T-Suppressorzellen durch FLS komplett aktiviert und zu einer anhaltenden IL- , IFN-γ- und IL-10-Produktion stimuliert wurden, während FLS bei den CD4+ T-Helferzellen die Expression von IL-2 hemmten. Die Anwesenheit der Synovialisfibroblasten erzeugt somit bei den CD4+, nicht aber bei den CD8+ T-Zellen einen Anergiezustand. Daher scheinen FLS zu RA-typischen Zytokinexpressionsmustern in den CD4+ und CD8+ T-Zellen durch unterschiedliche Mechanismen (Aktivierung von CD8+ T-Zellen versus Anergie der CD4+ T-Zellen) beizutragen. Die Aktivierung von MHC-I-restringierten CD8+ T Zellen sowie die Regulation von MHC-II restringierten CD4+ T Zellen durch FLS führt zu einer Modulierung der TH1/Th2 Zytokinbalance im Sinne entzündungshemmender Regulationsmechanismen. Bei der schweren RA Synovialitis sind diese Mechanismen aber offensichtlich unzureichend, um den Entzündungsprozess effektiv zu kontrollieren.
• Rheumatoid arthritis as a chronic inflammatory disease with its principal manifestation on joints cannot be completely inhibited in its progressive course by nowadays existing disease modifying antirheumatic medications. Persistent inflammation in progessive disease leads to an irreversible destruction of the cartilage and bone, and as a consequence to a serious loss of the articular function. There are convincing references in the past literature attracting a crucial role of the T cells in the immunopathogenesis of RA which besides different mechanisms of acquired immunity claim on matrix degrading processes by fibroblast-like synoviocytes (FLS). The secretion of proinflammatory cytokines by macrophages like IL-1β, TNF-α and IL-18 again results in the stimulation of inflammation supporting T cells to express IL-2 and IFN-γ. The importance of IL-17, another central T cell cytokine, was at that time not yet fully understood, and IL-23 not yet discovered. In this work freshly isolated peripheral mononuclear cells (PBMC) from venous blood (systemic component) and from the synovial fluid (SFMC, local component) of RA and control patients (other forms of arthritis) were separated by Ficoll density centrifugation, and the subpopulations of T cells were identified by FACS analyes through fluorescent immunostaining with monoclonal antibodies (mab) against the cell surface characteristics CD4, CD8, CD45RA and CD45RO to record their distribution in the systemic and local components. T cells were also investigated with reference to their activation state by staining with anti-CD69 mab and to their intracellular cytokine expression profile (IL-2, IFN-γ, IL-10) at a single cell level, after blockade of the cytokine secretion by Monensin and subsequent permeabilization of the cells by Saponin. The influence of autologous and allogeneic FLS on the T cells in regard to the above mentioned activation parameters (CD69 and cytokine expression) was examined in vitro using an autologous and allogeneic culture system performed by coculture of peripheral mononuclear cells with FLS obtained from RA patients with severe disease course. Here FLS, gained from the synovial membrane and the synovial fluid, were used after the fourth to fifth passage of long-time culturing. A preferential accumulation of CD45RO+ memory T cells was observed in both the subpopulation of CD4+ T helper cells and CD8+ T suppressor cells in all of the examined synovial fluids ex vivo irrespective of origin or underlying condition. In addition, the upregulation of CD69 as a sign of an early activation state could be demonstrated in both the CD45RA+ naïve CD4+ and CD8+ T cells in RA as well as control patients with other forms of arthritis, too. Nevertheless only in a small portion of these T cells the expression of IL-2 could be detected. These results confirm a preferential memory state of T-helper and suppressor cells invading into or persisting in the joint, and a for the most part incomplete activation of the naïve and memory T cells in RA and control patients. However, patients with RA and those with other forms of arthritis distinguish in regard with the expression of IL-10, known as an anti-inflammatory cytokine, and pro-inflammatory IFN-γ in PB and SF T cells. Here, CD8+ T cells appear to make the major contribution to the elevated IL-10 expression in RA. In accordance with the coculture experiment in this work we could demonstrate that only the CD8+ T cells were completely activated by FLS, and thus stimulated to produce IL-2, IFN-γ and IL-10 constantly, whereas FLS inhibited the IL-2 expression in CD4+ T-helper cells. Hence, the presence of FLS obviously leads to anergy exclusively in CD4+ T cells, but to activation of CD8+ T cells. For that reason, FLS seem to contribute to a characteristic cytokine pattern in RA CD8+ and CD4+ T cells by distinct mechanisms of activation versus anergy. In summary, the activation of MHC-I restricted CD8+ T cells and the regulation of MHC-II restricted CD4+ T cells by FLS modulate the Th1/Th2 cytokine balance towards regulatory mechanisms inhibiting inflammation. In severe RA synovitis these mechanisms may be insufficient to control the inflammatory process efficiently.