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Amany Balah

• IL-18, a recently identified member of IL-1 family, is now recognized as an important regulator of innate and acquired immune responses. Therefore, the antitumor activities of IL-18 have been investigated. IL-18 has been shown to induce IFN-γ production by T, B, and NK cells, enhances NK cell activity, activates Fas ligandmediated apoptosis of the tumor cells, and improves the overall antitumor immunity. KG-1 cells were derived from a patient with acute myeloid leukemia (AML). IL-18 has been shown to induce IFN-γ production in those leukemic cells. TLR-3, in addition to its ability to recognize viral double stranded RNA, also can recognize the synthetic analogue poly(I:C) and induces type I IFN, inflammatory cytokine production, e.g TNF-α, and maturation of denderitic cells. In the present work the potential modulatory effect of PIC on IFN-γ and TNF-α production by KG-1 cells treated with IL-18 was investigated. Indeed, PIC strongly amplified the production of IFN-γ induced by IL-18 on mRNA and protein levels via NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Compared to IFN-γ, TNF-α showed different behaviour in KG-1 cells. On mRNA level I found only weak induction of TNF-α by IL-18 which was potentiated in the presence of PIC. Similarly, the release of TNF-α by IL-18 plus PIC required NF-κB as well as p38 and JNK MAPK activation. Furthermore, in the present work I found that TLR-3 is required for IFN-γ and TNF-α production. In addition, it is demonstrated by immunofluoresence that TLR-3 is localized in cytoplasm but not on the cell surface in KG-1 cells. Recently, it has been demonstrated that IFN-γ shows therapeutic potential as detected in AML blasts, specifically via inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Thus our data could serve as a rationale for the clinical use of PIC and IL-18 in combination therapy. In search for new cytokines potentially modulated by the combination IL-18 plus PIC in KG-1 cells, cytokine antibody array analysis was performed. I found an upregulation of expected genes like IP-10 but most interestingly unexpected upregulation of PDGF-AA. Searching for detailed mechanisms of PDGF-AA induction, I found that neither p38 nor JNK is involved in PDGF-AA production but NF-κB is essential for the expression of PDGF-AA. Furthermore, I found that PDGF-AA is not able to increase the proliferation of KG-1 cells. PDGF and TGF-β are examples of signaling molecules which control the growth, survival, motility, and differentiation of cells. Therefore, the release of TGF-β by IL-18 plus PIC was monitored by ELISA. The level of TGF-β in cellular supernatants revealed that neither PIC nor IL-18 was able to significantly mediate release of TGF-β indicating that only PDGF-AA but not TGF-β is induced by PIC and IL-18 in KG-1 cells. To the best of our knowledge this is the first time that IL-18 or PIC is shown to induce the expression of PDGF-AA in KG-1 cells.
• 1. Amplifikation der IL-18-induzierten Freisetzung von IFNγ und TNFα durch das dsRNA Mimetikum poly (I:C) [PIC] Da IL-18 im Serum von Patienten mit akuter lympphatischer Leukämie oder chronisch myeloischer Leukämie als erhöhter Parameter identifiziert wurde, sind die anti-leukämischen Eigenschaften von IL-18 von besonderem Interesse. Es konnte in diesem Zusammenhang gezeigt werden, dass IL-18 die Produktion von IFNγ insbesondere durch T und NK Zellen potenziert. Darüber hinaus kann IL-18 auch in prädendritischen KG-1 Zellen IFNγ induzieren. Diese Zellen stammen aus einem Patienten mit akuter myeloischer Leukämie. Da dsRNA normalerweise nicht in Säugetierzellen zu finden ist, sondern stattdessen Zwischenprodukt viraler Replikation ist, wird sie von der Immunabwehr als fremd identifiziert (‚pathogenassociated molecular pattern’) und aktiviert so die angeborene Immunität. Entsprechend kann dsRNA die Bildung von Typ I Interferon und proentzündlichen Zytokinen, wie beispielsweise TNFα, durch dendritische Zellen anregen. In der vorgelegten Arbeit habe ich die modulatorische Funktion von poly(I:C) (PIC), einem synthetischen dsRNA Mimetikum, in bezug auf die Bildung von IFNγ und TNFα durch IL-18-stimulierte KG-1 Zellen untersucht. Zunächst wurde die Zytokinantwort von KG-1 Zellen unter dem Einfluss von PIC charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass PIC als Einzelstimulus in der Lage ist, in dosis-abhängiger Weise die Sekretion von IFNγ auszulösen. In nachfolgenden Untersuchungen konnte ich nicht nur IL-18 als potenten Aktivator von KG-1 Zellen bestätigen, sondern belegte darüber hinaus erstmals einen eindrucksvollen Synergismus zwischen IL-18 und PIC hinsichtlich der IFNγ Sekretion dieses Zelltyps. Dieser Synergismus war sowohl auf mRNA als auf Proteinebene nachweisbar. Im Vergleich zu IFNγ, zeigte TNFα anderes Verhalten. Auf mRNA Ebene war TNFα durch IL-18 nur schwach induzierbar. Auch hier zeigte sich allerdings eine Potenzierung durch Aktivierung der Zellen mit der Kombination IL-18 plus PIC. Die Stabilität seiner mRNA ist wichtiger Regulationspunkt der TNFα Synthese. PIC zeigt jedoch keine Aktivität hinsichtlich einer Stabilisierung der TNFα mRNA. Es kann daher angenommen werden, dass der Potenzierung der TNFα Expression durch die Kombination IL-18 plus PIC ein transkriptioneller Mechanismus zugrunde liegt. ..... 2. IL-18 und PIC induzieren die Expression von PDGF-AA in KG-1 Zellen Zur Identifikation neuer Zytokine, die durch die Kombination IL-18/PIC induzierbar sind, wurde eine ‚Antibody Array’ Analyse durchgeführt. Hierbei bestätigte sich die Induktion von Genen wie z.B. IP-10. Interessanterweise fanden wir in diesen Untersuchungen, dass PDGF-AA durch IL-18/PIC heraufreguliert wird. Bereits publizierte Studien zeigten, dass Il-1β die Sekretion von PDGF-AA aus Fibroblasten und glatten Muskelzellen aktivieren kann. In Zellen mit geeigneten Rezeptoren ist PDGF eine der wichtigsten Determinanten von Zellwachstum und Proliferation. In der vorliegenden Studie wurden deshalb die Effekte von IL-18/PIC detailliert untersucht. Die Kostimulation mit IL-18/PIC zeigte im Vergleich zu den Einzelstimuli einen additiven Effekt bezüglich der PDGF-AA Sekretion aus KG-1 Zellen. Weder die Freisetzung von PDGF-AA nach IL-18 als Einzelstimulus, noch die Freisetzung im Kontext einer Kostimulation mit IL-18/PIC wurde durch Hemmung der p38 oder JNK MAP Kinasen beeinflusst. Im Gegensatz dazu erwies sich IKKVII als potenter Inhibitor der PDGF Sekretion unter dem Einfluss von IL-18/PIC. Dies ist ein weiterer Hinweis auf die zentrale Bedeutung von NF-κB bei der Aktivierung von KG-1 Zellen. Interessanterweise konnte kürzlich gezeigt werden, dass NF-κB in physikalischer Interaktion mit ‚Krüppel-like factor 5’ (KLF5) die Aktivierung des PDGF-A Gens vermitteln kann. Um zu untersuchen, ob PDGF-AA auch durch andere Zytokine in KG-1 Zellen induziert werden kann, wurden neben IL-18 auch TNFα, IL-1β, IL-12 und IFNγ getestet (alle in einer Konzentration von 20 ng/ml). Es zeigte sich dabei, dass nur IL-18 und TNFα dazu in der Lage waren. ....