Open Access

Angelika Christina Keller

• Based on the commonly used and well-established state-of-the-art DNA sequencing method, i. e. Sanger sequencing, the major target of future research is to develop a fast, cost-effective and gelelectrophoresis-free sequencing method. The aim of the new sequencing technologies is to detect DNA mutations faster and more accurate in order to develop individual therapies for patients (personalized medicine). For this purpose, a lot of novel sequencing techniques like pyrosequencing, mass-spectrometry-assisted sequencing, sequencing by hybridization etc. have been put into practice and already led to commercialized sequencers. The sequencing technology we were mostly interested in is the so-called sequencing-by-synthesis method (SBS). This PhD thesis covers the synthesis of modified nucleosides – the so-called reversible terminators – and their evaluation as reversible terminators. These 3′-modified and dye-labeled nucleotides are incorporated by the polymerase into the DNA-template, then the DNA-synthesis is stopped. After detection of the fluorescent signal, the reversible terminator has to be cleavable in a way (i. e. the polymerase-blocking modification) that the DNA-synthesis can continue. As a result of the polymerase-acceptance tests that have been carried out with the two triphosphates cyanoethoxymethyl(CEM)-dTTP and cyanoethyl(CE)-dTTP as substrates it became clear that the latter one was better incorporated than the first one. Based on this knowledge all four key compounds for the whole reversible terminators possessing the cyanoethyl (CE) group where synthesized within this PhD thesis. Additionally to the synthesis of the modified key compounds, the cleavability of the cyanoethyl function had to be evaluated which is an essential requirement of a reversible terminator for SBS. For addressing this issue, three different CE- and CEM modified monophosphates were created. For each of these three monophosphates an individual synthetic strategy has been developed within this PhD work, each of these strategies and subsequent phosphorylation led to the desired modification. These previously unknown model compounds mimicking the solubility of short oligonucleotides were employed the for qualitative cleavage experiments after their purification and spectroscopical characterization. With these three monophosphates suitable cleavage conditions for a quantitative removal of the CE and the CEM group were examined. In case of the CE function we selectively improved the cleavage conditions while varying the solvent, the reaction temperature as well as the amount of cleaving agent used, in order to make the conditions applicable for an SBS experiment. Due to the fact that the CE function was the most important modification for our SBS experiment, we could even optimize the cleavage efficiency by employing co-solvents like DMSO or DMF. An additional cleavage experiment was carried out by using a short CE-modified oligomer which led to further results that were comparable to the ones obtained from the cleavage experiments of the monomers. One big difference is the required amount of TBAF as cleaving agent for the quantitative removal of the CE-modification from the oligomer. In this case, 7500 equivalents of TBAF are needed for complete CE cleavage at 45 °C compared to the amount of 40 to 80 equivalents TBAF for the monomer (monophosphate). As a conclusion of this result we assume that the amount of cleaving agent and the solubility of the oligomer plays an important role in the CE cleavage efficiency. This assumption was already supported by Saneyoshi et al. who demonstrated for CE-modified RNA oligonucleotides that the CE-cleavage rate is strongly lowered with the increasing of the oligomer length. Thus we could demonstrate that the CE function is quantitatively removable from an oligomer without destroying it. With these results in hands we could prove that the CEM and the CE group are quantitatively cleavable and therefore applicable as blocking groups for reversible terminators. The conditions for the CE cleavage are used for the ArraySBS-“proof-of-principle” which is currently under investigation.
• Basierend auf der weitverbreiteten und etablierten DNA-Sequenzierungs-methode der Wahl, i. e. Sanger-Sequenzierung, ist die Entwicklung neuartiger Methoden im Sinne eines schnelleren, gelelektrophoresefreiem und kostengünstigeren Sequenzierungsverfahren derzeit eine große Herausforderung in der Forschung. Die Zielsetzung dieser neuartigen Sequenzierungsverfahren ist es, schneller und präziser genbasierte Krankheiten detektieren und daraus resultierend individuelle Therapien für den Menschen entwickeln zu können. Hierzu wurden schon grundlegende und neuartige Sequenzierungsprinzipien, wie z. B. Pyrosequenzierung, Massenspektrometrie-basiertes Sequenzieren, Sequenzieren durch Hybridisierung etc. praktisch umgesetzt, d. h. neuartige Sequenzierungsgeräte werden heute schon kommerziell vermarktet. Ein für uns besonders interessantes Sequenzierungsverfahren der derzeit erforschten ist „sequencing-by-synthesis“, zu Deutsch die Sequenzierung durch Synthese (kurz SBS). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside - sogenannte reversible Terminatoren – für die Sequenzierung-durch-Synthese hergestellt und auf ihre Eigenschaft als Terminatoren bei der Polymerase-Reaktion geprüft. Reversible Terminatoren sind für die SBS-Methode unabdingbar: Es handelt sich hierbei um modifizierte Nukleotide in Form von farbstoffgelabelten Triphosphaten, die von einer Polymerase eingebaut werden und die DNA-Synthese temporär stoppen. Im selben Maße muss dieser Stopp aber reversibel sein, d. h. der Terminator muss derart spaltbar sein (in diesem Falle an der blockierenden Gruppe), dass er anschließend nach Detektion des Farbstoffes wieder die weitere DNA-Synthese erlaubt. In den Polymerase-Akzeptanztests mit den 3′-modifizierten Nukleosiden, die im Rahmen eines EU-Projektes sowohl jeweils mit cyanoethoxymethyl(CEM)-dTTP als auch mit cyanoethyl(CE)-dTTP als Substrat durchgeführt wurden, zeigte sich, dass letzteres der beiden Nukleotide von der Polymerase besser eingebaut wurde als ersteres. Auf diesem Wissen basierend wurden alle vier Schlüsselverbindungen der reversiblen Terminatoren, welche die Cyanoethyl-Gruppe besitzen, im Rahmen dieser Doktorarbeit synthetisiert. Darüber hinaus war auch die quantitative Spaltbarkeit der CE- und der CEM-Funktion zu prüfen. Dazu wurden im Rahmen dieser Arbeit modifizierte Monophosphate über eine jeweilige individuelle Synthesestrategie hergestellt. Diese bislang unbekannten Modellverbindungen, welche die Löslichkeit kurzer Oligonukleotide nachahmen sollten, wurden nach ihrer Synthese und spektroskopischer Charakterisierung für qualitative Spaltungsexperimente eingesetzt. Somit wurden geeignete Spaltungsbedingungen für die Cyanoethoxymethyl (CEM)- als auch für die Cyanoethyl (CE)-Funktion gefunden. Für die Cyanoethyl-Gruppe wurden die Spaltungsbedingungen gezielt optimiert, indem das Lösungsmittel, die Reaktionstemperatur sowie die eingesetzte Menge an Spaltungsreagenz variiert wurde, um die Bedingungen für ein SBS-Experiment anwendbar zu machen. Ein zusätzliches Cyanoethyl-Spaltungsexperiment, das mit einem kurzen Oligomer durchgeführt wurde, lieferte weitere Resultate, die mit den aus den Spaltungstests der Monomere gewonnenen übereinstimmen. Ein großer Unterschied zwischen den Monomeren und dem Oligomer bezüglich der Spaltungseffizienz ist die benötigte Menge an Spaltungsreagenz. Im Falle des Oligomers werden 7500 Äquivalente benötigt, um die Cyanoethyl-Gruppe bei 45 °C vollständig zu entfernen. Im Gegensatz dazu werden im Falle des Monophosphats nur 40 bis 80 Äquivalente benötigt. Basierend auf dieser Beobachtung kann man annehmen, dass sowohl die Löslichkeit des Oligomers als auch die TBAF-Konzentration eine entscheidende Rolle in der Effizienz der CE-Spaltung spielt. Dies wurde auch schon von Saneyoshi et al. demonstriert, der postulierte, dass im Falle der RNA die Abspaltung der Cyanoethyl-Gruppe in Abhängigkeit von der Größe des Oligomers verzögert wird. Wir haben demnach zeigen können, dass die CE-Gruppe mit TBAF in THF quantitativ abspaltbar ist, ohne dass das Oligonukleotid zerstört wird. Darüber hinaus wurde die Spaltbarkeit und damit die Reversibilität der CEM- und der CE-Gruppe als blockierende Gruppen bestätigt. Die Bedingungen aus dem CE-Oligomer-Spaltungstest werden derzeit im SBS-„Proof-of-Principle“, welches mit Hairpin-Templaten auf einem DNA-Chip Array durchgeführt wird, angewandt und optimiert.