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Martin Löwer

• Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
• Helicobacter pylori (H. pylori) is a Gram negative, microaerophilic bacterium. It colonizes the human gastric mucosa and more than 50 % of the human population is infected. Experimental results hint that H. pylori needs to interact with certain membrane proteins of the host cells in order to build a type IV secretion system and translocate the primary virulence factor Cytotoxin Associated Antigen A (CagA) into the cytoplasm of the host cell. These membrane proteins are called integrins and are expressed mainly at the basloateral surface of polarized epithelium cells. Also E-cadherin fragments can be found in the medium of culture cells infected by H. pylori. Both observations suggest that H. pylori actively secretes a protease in order to degrade the cell-cell contacts, allowing access to the basolateral surface of the host cells. The gene hp1019 of H. pylori strain 26695 codes for the secreted protein HtrA, which was shown to be an active protease and is located in the supernatant of H. pylori cultures. The aim of this work is to find a small molecule inhibitor for the protease HtrA in order to study the influence of this protease on the pathogenesis of H. pylori infections. A homology model of HtrA based on the template DegP of Escherichia coli (PDB identifier 3CS0) is used to perform a structure based virtual screening. Within this task a novel method for structure based virtual screening was developed. The software PocketPicker is used to predict shape and size of potential binding sites on protein surfaces. By projecting complementary interaction features of the protein atoms inside this defined space a structure based pharmacophore model is calculated and used for database screenings. In retrospective studies this approach was validated for a range of protein targets of pharmaceutical interest. The performance of the screening was dependent on the quality of the PocketPicker predictions. An overestimation of the size of the binding site may lead to a decreased enrichment. Three different structured based pharmacophore models were calculated for the protease HtrA, each including a different set of predicted binding sites. The compound databases of the commercial providers Asinex and Specs were screened using this models and a total of 26 compounds were picked from the result lists. Six compounds inhibit the proteolytical activity on a recombinant substrate in an in-vitro assay. The best performing compound has a maximal inhibition of about 77%. The half maximum inhibition (IC50) is achieved at a concentration of about 26 microM. This molecule can serve as a starting point for a further optimization towards a lead compound.