Open Access

Michael-Paul Vockenhuber

• Streptomyces coelicolor ist der Modellorganismus der GC reichen, Gram+ Actinomyceten, die mehr als zwei Drittel aller bekannten Antibiotika produzieren. Phänotypisch zeichnet er sich durch die Bildung eines Substrat- und eines Luftmyzels aus, welches im Laufe der weiteren Differenzierung Sporen bildet. Streptomyceten produzieren neben Antibiotika noch eine Vielzahl biotechnologisch interessanter Metaboliten. Der komplexe Lebenszyklus und Stoffwechsel erfordern eine genaue Regulation der Genexpression. Die letzten Jahre haben gezeigt, dass neben Proteinen auch die RNA eine regulatorische Funktion hat. Verschiedene regulatorisch aktive RNA Elemente wie Riboswitche, RNA-Thermometer und kleine nicht kodierende RNAs (small noncoding RNAs – sRNAs) wurden identifiziert. sRNAs wirken meist als antisense Riboregulatoren, indem sie ihre Ziel-mRNA binden und dadurch die Translation hemmen oder fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene bioinformatische Methoden verwendet, um sRNAs im Genom von S. coelicolor vorherzusagen. Es wurden Terminatorstrukturen und konservierte Sekundärstrukturen in den intergenen Regionen vorhergesagt, die keinem Gen zuzuordnen waren. In einem weiteren Ansatz wurden Bindestellen des Regulatorproteins DasR vorhergesagt, um DasR kontrollierte sRNAs zu identifizieren. Zusätzlich wurde mittels 454 Sequenzierung erstmalig das Transkriptom von S. coeliocolor analysiert. Auf diese Weise konnten etwa 500 sRNAs vorhergesagt werden. Eine der beiden charakterisierten sRNAs, sc32, ist 139 nt lang. Ihr Promoter liegt im kodierenden Bereich des Gens bldC und sie wird spezifisch durch Kälteschock induziert. Die zweite charakterisierte sRNA, sc1, ist 159 nt lang und in allen sequenzierten Streptomyceten konserviert. Ihre Expression wird nur bei Stickstoffmangel in der Stationärphase reprimiert. Durch molekularbiologische Analysen konnte ein Zielgen von sc1 identifiziert werden, die extrazelluläre Agarase DagA. Es konnte gezeigt werden, dass sc1 an die dagA-mRNA bindet und dadurch die Translation inhibiert. Als zweites mögliches Ziel von sc1 konnte die Histidinkinase SCO5239 identifiziert werden. Hier wurde gezeigt, dass Koexpression von sc1 die Expression einer SCO5239 Reportergenfusion um den Faktor acht steigert. Durch Analyse des Proteoms von sc1 Mutanten, konnte die differenzierte Expression von elf weiteren Proteinen gezeigt werden. Sc1 scheint als Regulator zu agieren, indem es auf die Stickstoffversorgung der Zelle reagiert und den Sekundärmetabolismus deaktiviert.
• Streptomyces coelicolor is the model organism for the class of GC rich, gram+ actinomycetes that produce more than two thirds of all known antibiotics. It grows in a characteristic substrate and areal mycelium that during further development diffentiaties into spores. Next to antibiotics, Streptomycetes produce a variety of biotechnological interesting metabolites. This complex life cycle and metabolism demands a strict regulation of gene expression. The last years have shown, that next to proteins also RNA can have a regulatory function. Numerous regulatory active RNA elements like riboswitches, RNA-thermometers and small non coding RNAs (sRNAs) have been identified. In most cases sRNAs act as antisense riboregulators by binding to their target-mRNA and thereby blocking or activating its translation. In this work, several different bioinformatic methods were used to predict sRNAs in the genome of S. coelicolor. With these methods terminators and other conserved secondary structures in the intergenic regions of the genome that could not be assigned to an annotated gene were predicted. In another approach binding sites for the global regulator protein DasR were predicted to identify DasR-controlled sRNAs. Additionally for the first time the transcriptome of S. coelicolor was analyzed by 454 deep sequencing. Using this methods ~ 500 sRNAs could be predicted in the genome of S. coelicolor. One of the two characterized sRNAs – sc32 – is 139nt long. Its promoter resides in the conding region of the gene bldC and its expression is specifically induced by cold-shock conditions. The second characterized sRNA – sc1 – is 159nt long and conserved among all Streptomyces species sequenced today. Its expression is repressed by nitrogen starvation in stationary phase. By biochemical analyses a target mRNA of sc1 could be identified – the extracellular agarase dagA. It could be shown that sc1 binds to the dagA-mRNA and thereby hinders translation. As a second putative target of sc1 the histidine kinase SCO5239 could be identified. It was shown that coexpression of sc1 increases the expression of an SCO5239 reporter gene fusion eight times. Analysis of the proteome of sc1 mutants showed a differential expression of further eleven proteins. Sc1 seems to act as a regulator by sensing the nitrogen supply of the cell and in response deactivating the secondary metabolism.