Open Access

Patrick Schulz

• Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.
• Chloride channels and transporters are involved in important biological processes [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008]. Loss of function mutations can be related to several human diseases [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Despite this significant physiological relevance, these proteins represent an under-explored target class in pharmacological drug screening [Verkman & Galietta, 2009]. Robust high throughput methods are still missing. Especially members of the intracellular CLC-family, of which two already could be related to human diseases (ClC-5 – Dent´s disease; ClC-7 – osteopetrosis), are inaccessible to conventional electrophysiological methods (patch-clamp, TEVC) due to their vesicular localization. For that reason we introduced the SSM-technique [Schulz et al., 2008] to characterize the lysosomal Cl-/H+-antiporter ClC-7. Assuming a proper membrane preparation this method is capable to investigate also vesicular transport processes electrophysiologically. Beside the basic biophysical characterization of ClC-7, it was possible to demonstrate the proton coupled transport activity of that protein directly. Furthermore, a robust assay could be established, which allows the pharmacological investigation of ClC-7. It could be shown that ClC-7 is inhibited specifically by the chloride channel-blockers DIDS and NPPB with relatively high affinities (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM). Because ClC-7 is also discussed as target for osteoporose therapy [Schaller et al., 2005], the SSM-technique opens the possibility for pharmacological drug screening of that transporter. Apart from the wildtype, an osteopetrosis related mutant (G215R) was additionally investigated for transport function. A significant transport activity could be demonstrated, but a severe localization defect, which prevents the protein to reach the lysosomes, was found. Co-expression of its functional beta-subunit Ostm1 [Lange et al., 2006] could restore the lysosomal localization to some extend but not completely. Therefore, this effect could be an additional reason for the relatively mild course of disease of this autosomal dominant osteopetrosis (ADOII, Alberts-Schönberg disease) related to this mutation. Because the SSM-technique was only used for characterization of primary and secondary active transporters in the past [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], we furthermore investigated the applicability for the characterization of passive ion channels. Therefore, we used the well characterized ligand-gated P2X2 receptor. Comparison of the obtained electrophysiological and pharmacological results with data of conventional electrophysiological investigations confirmed the applicability of the SSM-technique for the characterization of ion channels. Currents across ion channels are controlled by the application of an external voltage in conventional methods. Because the external voltage control cannot be used with the SSM-technique, we finally tried to establish a voltage control by means of the light driven proton-pump bacteriorhodopsin (bR). Using a fusion-based model system [Perozo & Hubbell, 1993] it could be shown, that light driven ion pumps are useful to obtain voltage control at the SSM in principle. However, direct co-expression of bR in CHO cells is not suitable, due to its low plasmamembrane localization. The use of eucaryotic ion pumps combined with anion diffusion potentials [Perozo & Hubbell, 1993] might be a promising strategy to open the SSM-technique for the characterization of strongly voltage dependent ion channels.